Marcadores Moleculares

Transcrição

1 Marcadores Moleculares

2 Marcadores Moleculares

3 Marcadores Genéticos Características polimórficas: marcadores de variabilidade genética entre indivíduos, populações, espécies e taxons superiores. Marcadores moleculares: características moleculares polimórficas.

4 Marcadores Moleculares Proteínas/Enzimas. Genes. Segmentos de DNA não codificadores.

5 Aplicações

6 Busca por genes candidatos Região do DNA associada a uma característica de interesse (estudos de associação). Mapas físicos de cromossomos e de genomas: marcadores moleculares. Estudos de ligação entre alelo do marcador molecular e característica de interesse. Sequenciamento da região do marcador molecular e busca por genes candidatos.

7 QTLs (Locos de Características Quantitativas) Complexidade da Arquitetura Genômica: nº de Locos; suas interações e seus efeitos fenotípicos. Tamanho da amostra, densidade de marcadores, distribuição de marcadores, número de características quantitativas consideradas.

8 Genética forense. Ferramentas de manejo: genética da conservação. Auxiliares na análise sistemática: diferenças e semelhanças evolutivas entre os táxons.

9 Diferentes características e aplicações Abundância genômica. Nível de polimorfismo. Especificidade de locus. Codominância dos alelos. Reprodutibilidade. Quantidade de DNA. Custos. Acessibilidade técnica.

10 Técnicas baseadas em PCR: Sequenciamento de DNA; SSCP; Microssatélites; RAPD; SCAR; PCR-RFLP. Técnicas não baseadas em PCR: Alozimas; RFLP; Minissatélites.

11 Abundância Genômica Nível de polimorfismo Especificidade de locus Codominância dos alelos Alozimas RFLP Mini Micro RAPD SCAR SSCA CAPS Baixa Alta Média Alta Alta Baixa Baixa Baixa Baixo Médio Alto Alto Médio Médio Baixo Médio Sim Sim Não Sim Não Sim Sim Sim Sim Sim Não Sim Não Sim Sim Sim Reprodutibilidade Alta Alta Alta Alta Baixa Alta Médio Alta Demanda/trabalho Baixa Alta Alta Baixa Baixa Baixo Média Média Demanda/técnica Baixa Alta Alta Média Baixa Baixo Média Baixa Custo operacional Baixo Alto Alto Baixo Baixo Baixo Médio Baixo Custo de desenvolvimento Baixo Alto Alto Alto Baixo Médio Alto Médio Qtidade de DNA - Alta Alta Baixa Baixa Baixa Baixa Baixa Automação Não Não Não Sim Sim Sim Não Sim

12 Alozimas Variantes alélicos de enzimas codificadas por genes estruturais. Aplicações: genética de populações e estudos de padrão de herança. Vantagens: baixo custo e baixa demanda técnica, alta reprodutibilidade, alelos codominantes. Desvantagens: baixa abundância, baixo nível de polimorfismo e co-migração de não homólogos.

13 Silene latifolia ssp. alba

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17 G6PD cromossomo X

18 BChE

19 RFLP Restriction fragment Length Polymorphism Polimorfismo de tamanho dos fragmentos de restrição. Aplicações: análise sistemática; mapeamento de genes; genética de populações. Vantagens: abundância genômica; alelos codominantes e alta reprodutibilidade. Desvantagens: alta demanda técnica e de trabalho, grande quantidade de DNA de alto peso molecular.

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21 Cruzar SS X ss e produzir F1. DNA foi extraído dos dois parentais e de cinco plantas F1, digerido com BgII, submetido à eletroforese e transmitido por Southern Blot a uma membrana de nitrocelulose. Uma sonda marcada radioativamente foi hibridizada com a membrana de nitrocelulose.

22 Minissatélites (VNTR/LTR) Hibridização Southern blot: sondas multilocus. Aplicações: DNA fingerprinting (genética forense) Vantagens: alto nível de polimorfismo e alta reprodutibilidade Desvantagens: altos custos e demanda técnica; sem especificidade de locus ou de alelos. Sondas locus específicas: clonagem molecular de fragmentos de restrição.

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24 Microssatélites (STR) Aplicações: genética de populações, mapeamento de genes, genética forense. Vantagens: alta abundânica genômica, alto nível de polimorfismo, pequena quantidade de DNA, alta reprodutibilidade, alelos codominantes, locus específicos. Desvantagens: alelos nulos mutações no sítio de anelamento dos primers, erros de amplificação.

25 Alelo 1 15 repetições CA Alelo 2 17 repetições CA Alelo 3 18 repetições CA

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28 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) PCR com primers curtos (10 pb) de sequência randômica. Um primer forward e reverse amplifica fragmentos em 1 10 sítios genômicos simultaneamente. Fragmentos entre 0,5 5 kb: presença e ausência de bandas Aplicações: mapeamento de genes; identificação genética de indivíduos e de linhagens e de espécies próximas. Vantagens: alta abundânica genômica; alto nível de polimorfismo; pequena quantidade de DNA; disponibilidade de primers randômicos. Desvantagens: baixa reprodutibilidade; locus inespecífico e alelos dominantes.

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30 SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) Amplificação com primers específicos (15-30 pb) a partir das sequências de nucleotídeos de fragmentos de RAPD clonados. Polimorfismos de tamanho são detectados por eletroforese. Aplicações: mapeamento de genes e melhoramento genético Vantagens: rápido e fácil; alta reprodutibilidade; alelos codominantes e pequena quantidade de DNA. Desvantagens: ensaio de RAPD prévio e sequência conhecida para desenhar primers específicos.

31 SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) Fragmentos de DNA ( pb) amplificados por PCR primers (20-25 pb). DNA é desnaturado antes da eletroforese (calor, NaOH e formamida) e o gel não é desnaturante. Aplicações: detecção de mutação em regiões de sequência conhecida (principalmente genes) e estudos de associação. Vantagens: alelos codominantes e pequena quantidade de DNA. Desvantagens: sequência conhecida; controle das condições de eletroforese; uso de controles e fragmentos pequenos.

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33 Exemplo PCR-SSCP

34 PCR -RFLP (Restriction fragments length polymorphism) Fragmentos de DNA amplificados por PCR (300 a 1800 pb) primers específicos (20-25 pb). Digestão dos fragmentos amplificados com enzimas de restrição:polimorfismos de tamanho variação na ocorrência de sítios de restrição. Aplicações: mapeamento de genes; estudos de associação. Vantagens: alelos codominantes; pequena quantidade de DNA e alta reprodutibilidade. Desvantagens: sequência conhecida para desenho de primers específicos, baixa abundância genômica.

35 Criando um sítio de restrição ALA Sequência normal...5'..gaa GCA GAA TGG...GCA GG...3' Iniciador (3') GT CGT ACC...CGT CC Produto da PCR 5'..GAA GCA GCA TGG...3' Fnu4HI ou BsoFI 85 pb ' 21 pb

36 Gel de agarose, mostrando os 3 genótipos

37 Projeto 1000 genomas html

38 Projeto 1000 genomas O Projeto 1000 Genomas funcionou entre 2008 e 2015, criando o maior catálogo público de dados de variações e genótipos humanos. O objetivo foi encontrar a maioria das variantes genéticas com frequências de pelo menos 1% nas populações estudadas.

39 Projeto 1000 genomas

40 Projeto 1000 genomas

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