12/04/2012. aplicações para o diagnóstico direto em doenças transmissíveis. Identificar um agente pelas características de seus ácidos nucléicos

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1 aplicações para o diagnóstico direto em doenças transmissíveis Inferir sobre a presença de um agente pela presença de seus ácidos nucléicos Presença de ácidos nucléicos de um agente significa infecção ativa? Identificar um agente pelas características de seus ácidos nucléicos DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR 1 2?? 3 4 Genoma, Genes, DNA, RNA Genomas Nuclear Mitocondrial Cloroplastos e apicoplastos Bacteriano Viral Príons e viróides 5 6 1

2 Cerca de minicírculos e 50 maxicírculos por complexo

3

4 RNA proteína Diferentes alvos para objetivos específicos 1 organismo = 1 alvo 1 organismo = n alvos SENSIBILIDADE ANALÍTICA viróides e prions são moléculas infecciosas alvo exclusivo para um dado organismo ESPECIFICIDADE ANALÍTICA Mutações Substituições Inserções e deleções Recombinações Introdução Caracterização de microrganismos Técnicas de biologia molecular Diagnóstico de doenças infecciosas Detecção de agentes etiológicos Tipificação de microrganismos Divisão de microrganismos em grupos definidos Métodos utilizados Caracterização dos agentes etiológicos detectados Métodos fenotípicos características observáveis resultantes da interação do genótipo com o meio ambiente Métodos genotípicos constituição genética ou carga genética particular de um indivíduo 4

5 Métodos fenotípicos Métodos fenotípicos Características morfológicas Biotipagem Sensibilidade a antibióticos Atividade bioquímica frente a substratos diversos Antibiograma Métodos fenotípicos Métodos genotípicos Fagotipagem Sensibilidade bacteriana à infecção por vírus bacteriófagos Sorotipagem Eletroforese protéica Determinação do padrão protéico Classificação dos organismos de acordo com a variabilidade genética observada Maior capacidade de detecção de variabilidade entre microrganismos Diferenças nas seqüências de nucleotídeos Associação a determinadas características fenotípicas do organismo ou a outras características importantes Marcadores para características de interesse = marcadores moleculares Variabilidade genotípica A T G A T A A T G C C T A Substituição Duplicação A T G C T A Origem da variabilidade genotípica Deleção A T C T A Inserção A T G A C T A A T G C T A A T G G A T T A C G A T T A C C T A Translocação 5

6 Variabilidade genotípica Marcadores moleculares Diferentes regiões do genoma = diferentes taxas de mutação Regiões variáveis x regiões conservadas Escolha do marcador: objetivos da caracterização Marcadores para identificação de gênero de microrganismos Regiões conservadas entre diversos indivíduos do gênero do microrganismo de interesse Variabilidade quando comparadas com outros gêneros de microrganismos Marcadores para discriminação de espécies dentro de um gênero de microrganismo Variáveis quando se compara indivíduos de diferentes espécies Conservadas entre diferentes cepas de uma mesma espécie Alinhamento do gene codificador da unidade 16S do RNA ribossomal Diversas espécies de Brucella Região conservada Brucella ovis Alinhamento do gene omp2 (Outer Membrane Protein) Diversas espécies de Brucella Região de variabilidade Marcadores moleculares Identificação de diferentes cepas (variantes) dentro de uma mesma espécie de determinado microrganismo Alinhamento gene codificador proteína capsídeo Isolados de Calicivirus felino Região de alta variabilidade Regiões que apresentem com variabilidade intra-específica Variabilidade associada a características importantes 6

7 Marcadores moleculares Marcadores moleculares Marcador de resistência a antibióticos Marcadores de fatores de virulência Mutações ou aquisição de genes relacionados à resistência microbiana a antibióticos Cepas comensais E coli Cepas patogênicas Cepas resistentes: presença da mutação / gene Cepas sensíveis: ausência da mutação / gene Identificação de genes codificadores de fatores de virulência Fatores de virulência Fímbrias: adesão Toxinas: diarréia Marcadores moleculares Marcadores de especificidade de hospedeiros Giardia duodenalis Gene codificador da enzima da glutamato desidrogenase (gdh) Genótipos A e B: humanos e animais Genótipos E: livestock Genótipos F: felinos Genótipos C: cães Marcadores moleculares Distribuição de microrganismos no tempo / espaço e transmissão Variantes genotípicas de microrganismos agrupadas em determinadas localidades ou ocorrendo em determinados períodos Comparação de microrganismos oriundos de diferentes localidades e períodos Determinação de rotas de transmissão de agentes infecciosos numa população Identificação de fontes de infecção na ocorrência de surtos Identificação de fatores de risco Auxílio no controle e prevenção da infecção Métodos de caracterização Técnicas que não dependem de conhecimento prévio da seqüência de DNA do organismo a ser caracterizado Técnicas que dependem de conhecimento prévio da seqüência de DNA do organismo a ser caracterizado Métodos de caracterização Capacidade de tipagem: refere-se a habilidade da técnica em atribuir um tipo bem definido para cada isolado Reprodutibilidade: refere-se a habilidade da técnica em acessar o mesmo perfil de determinada amostra independente da ocasião Estabilidade: refere-se a estabilidade dos marcadores acessados pela técnica que não se alteram com facilidade caracterizando a amostra em questão Poder discriminatório: capacidade de discriminar cepas altamente similares 7

8 Métodos de caracterização Eletroforese em campo pulsátil Técnicas que não dependem de conhecimento prévio da seqüência de DNA do organismo a ser caracterizado Digestão do DNA genômico com enzimas de restrição e posterior eletroforese dos fragmentos de DNA gerados Enzimas de restrição = endonucleases Produzidas por bactérias Clivagem de DNA estranho Proteção contra infecção por bacteriófagos Enzimas isoladas de bactérias e produzidas em laboratório Reconhecimento de seqüências de DNA específicas de 4 a 8 bp Sítios de restrição Clivagem da dupla fita de DNA nestes sítios Cada enzima é específica para uma determinada seqüência de DNA Utilizadas em estudos de genotipagem de microrganismos seqüências palindrômicas Diferentes organismos Diferenças na localização e no número de sítios de restrição Variabilidade genotípica Fonte: www-math.mit.edu 8

9 EcoRI A EcoRI B G A A T TC C T T A A G G T A T T C C A T A A G Extração do DNA genômico (total) do microrganismo de interesse Reação de restrição enzimática G A A T T C G G T A T T C C A T A A G Clivagem do DNA extraído de acordo com a presença de sítios de restrição C T T A A Eletroforese em gel de agarose para visualização dos fragmentos de 2 fragmentos de DNA 1 fragmento de DNA DNA gerados Visualização dos fragmentos gerados Eletroforese em gel de agarose Organismo A Organismo B Fragmentos maiores do que 25 kb Não separados pela eletroforese convencional Gel de agarose a 0,8 a 1,2 % Separação de fragmentos de 10 a 800 kb Mudança periódica na orientação do campo elétrico através do gel (pulsos) 9

10 Figure 2. Example of a real PFGE; drug resistant Staphylococcus aureus. The molecular weight markers are digested lambda phage (λ) and are given in kb Fonte: 10

11 Vantagens Alta reprodutibilidade Alto poder discriminatório: discriminação de microrganismos relacionados Extração de DNA Aplicada para caracterização de grande variedade de organismos Desvantagens Utilização Utilização apenas em microrganismos isolados Incubações prolongadas para extração Eletroforese prolongada Alto custo do equipamento Dificuldade de comparação de resultados obtidos entre diferentes laboratórios Staphylococcus aureus: variabilidade intra-específica Gênero Brucella spp: identificação de espécies de Brucella e baixa variabilidade intra-específica Random Amplified Polymorphic DNA - RAPD Random Amplified Polymorphic DNA - RAPD Reação de PCR com primers randômicos, aleatórios Único primer com 8 a 10 bp Primers não específicos Sem conhecimento prévio da seqüência alvo Pareamento a diversos loci do genoma Amplificação de múltiplos produtos Distância entre sítios de hibridização Extração de DNA do organismo de interesse Reação de amplificação em condições de baixa estringência Amplificação em sítios de pareamento imperfeito Visualização dos produtos amplificados em eletroforese em gel de agarose ACGTCCAG ACGACCAG ACGTCCAG ACGTCTAG 11

12 Random Amplified Polymorphic DNA - RAPD Random Amplified Polymorphic DNA - RAPD Número e localização dos sítios de pareamento variam entre diferentes cepas Cepa 1 Cepa 2 Variabilidade nas seqüências de nucleotídeos Random Amplified Polymorphic DNA - RAPD Fingerprinting Cepa 1 Cepa 2 Random Amplified Polymorphic DNA - RAPD Random Amplified Polymorphic DNA - RAPD Vantagens Alto poder discriminatório Caracterização intra-específica de diversos organismos Baixo custo Desvantagens Baixa reprodutibilidade Condições de amplificação, equipamentos Bandas de diferentes intensidades: diferentes eficiências de amplificação em diferentes sítios Concentrações definidas de DNA extraído Dificuldade de análise e comparação de resultados Utilização apenas em isolados 12

13 Random Amplified Polymorphic DNA - RAPD Métodos de caracterização Utilização Caracterização intra-específica Staphylococcus e Enterobacteriaceae Técnicas que dependem de conhecimento prévio da seqüência de DNA do organismo a ser caracterizado Brucella: variabilidade intra-específica Seqüenciamento PCR e posterior determinação direta da seqüência de nucleotídeos do produto amplificado Identificação de seqüências variáveis Possibilidade de caracterização de organismos diretamente em materiais clínicos Custo do equipamento e reagentes Banco de dados de seqüências geradas: comparação direta de seqüências Desenho de primers específicos Reações de PCR utilizando primers para identificação de marcadores específicos Pesquisa por regiões de interesse: seqüências disponíveis nos bancos de dados Alinhamento das seqüências disponíveis Identificação das regiões de interesse: grau de variabilidade compatível com o objetivo da caracterização 13

14 Primer Primer primer foward primer reverse B. ovis foward Deleção de 50 bp na cepa 2 reverse Gene omp2 Marcador Brucella ovis primer reverse demais brucelas 100 bp 100 bp Cepa 1 = 250 bp Cepa 2 = 200 bp Desenho de primers específicos Vantagens Primers específicos: resultados reprodutíveis Possibilidade de utilização em materiais clínicos Proteína capsídeo Calicivírus felino Rápida detecção e caracterização de microrganismos Desvantagens Desenho de primers específicos Conhecimento prévio da seqüência alvo PCR - RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Amplificação de um fragmento de DNA de interesse utilizando primers específicos (PCR) Constante atualização Purificação e digestão do produto amplificado com enzimas de restrição Análise por eletroforese 14

15 ATCGGTCAGGGATCGAGCGTTACGGGTCCGATTTCAGCCGGTGCCAGCGGTCTCG Primer foward Primer reverse Marcador para Brucella canis Gene omp 31 GGTCC Sítio de restrição da enzima AvaII ATCGGTCAGGGATCGAGCGTTACGGGCCCGATTTCAGCCGGTGCCAGCGGTCTCG Primer foward Primer reverse B. canis demais B. canis demais PCR - RFLP Vantagens Alta reprodutibilidade: primers específicos Baixo custo Desvantagens Purificação do produto amplificado Reação de restrição enzimática Poder discriminatório: restrito ao lócus amplificado Alguns casos: necessidade de grande número de enzimas Utilização - Brucella PCR - RFLP Elementos repetidos omp 2 13 enzimas B. abortus bt. 1, 2 e 4 omp 31 4 enzimas omp 25 9 enzimas Seqüências de nucleotídeos que se repetem ao longo do genoma B. suis bt. 1 e 2 B. suis bt. 5 B. neotomae B. suis bt. 2 B. canis B. melitensis bt 1, 2, 3 B. ovis Genoma de eucariotos e procariotos B. ovis B. ovis Mamíferos marinhos Intra-específico: B. Diversos arranjos de repetições melitensis e B. ovis 15

16 TTTGCTAT AGGCTT Seqüências de inserção Insertion sequences - IS Seqüências de nucleotídeos que se repetem ao longo do genoma de maneira dispersa Diferentes números e localizações de acordo com a espécie ou cepa Elementos móveis IS 711 B. suis bt bp Vantagens Seqüências de inserção IS bp B. abortus bt. 1, 2, 4 Primers específicos: alta reprodutibilidade Possibilidade de utilização em materiais clínicos IS bp B. melitensis Desvantagens Elementos móveis IS bp B. ovis Objetivo? Marcador de espécie ou marcador intra-específico Definição Seqüências de nucleotídeos que se repetem ao longo do genoma Repetições arranjadas em tandem Unidade repetição = CAGC ATGGCATAATGTTCAGCCAGCCAGCCAGCCAGCCAGCAAGCGACTGTACATGT : unidade repetida entre 1 e 6 pares de bases Minissatélites: unidade repetida entre 7 e 100 pares de bases Satélites: unidade repetida maior que 100 pares de bases TTTTTTTTTT (Poli T) (unidade repetida = 1bp) ATATATATATATATATATATAT (unidade repetida = 2bp) GGCGGCGGCGGCGGCGGCGGC (unidade repetida = 3bp) CAGCCAGCCAGCCAGCCAGCCAGC (unidade repetida = 4bp) ATTCTATTCTATTCTATTCT (unidade repetida = 5bp) TAGCAATAGCAATAGCAATAGCAATAGCAA (unidade repetida = 6bp) AGGGCAGTAGGGCAGTAGGGCAGTAGGGCAGT (unidade repetida = 8bp) 16

17 Definição Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) Número Variável de Repetições em Tandem Short Sequence Repeats (SSR) Pequenas Seqüências Repetidas Definição CAGCCAGCCAGCCAGCCAGC vntr DNA - codificadora TTATCTTATCTTATCTTATC vntr DNA -não codificadora Short Tandem Repeats (STR) Pequenas Repetições em Tandem proteína Variabilidade Variabilidade Regiões com elevada taxa de mutação elevada variabilidade Resultante da variação no número de unidades repetidas Variabilidade observada inclusive entre indivíduos de uma mesma espécie Bactérias: variabilidade intra-específica Humanos: padrões individuais Diferentes loci microssatélites diferentes taxas de mutação Organismo 1 Organismo 2 Variabilidade Slipped-strand mispairing (SSM) Pareamento errôneo das fitas de DNA durante a replicação in vivo Mecanismo de reparo da polimerase: adição e deleção de unidades repetidas Variabilidade Nova fita Fita molde Nova fita Fita molde = AGGC

18 Variabilidade Nova fita = AGGC Função na célula bacteriana Variabilidade em loci microssatélites = estratégia de adaptação Fita molde Nova fita Fita molde bacteriana Mutação em loci microssatélites alteração da expressão de determinados genes Haemophylus Neisseria Staphylococcus Vantagens seletivas a determinadas populações bacterianas Função na célula bacteriana Alteração na expressão de proteínas de superfície, impedindo o reconhecimento imunológico e possibilitando a colonização e sobrevivência bacteriana (E. coli) Expressão de adesinas e fatores de invasão de células do hospedeiro: colonização bacteriana Aquisição de nutrientes Resistência a antibióticos e genotipagem Identificação de variantes dentro de determinadas espécies bacterianas Resistência a antibióticos Diferentes graus de virulência Loci microssatélites hipermutáveis: rastreamento de infecções e genotipagem Cepa 1 Metodologia para análise Primer 1 8 bp 8 bp Primer 2 Testes de paternidade Região flaqueadora 50 bp ATGGGCAT ATGGGCAT 16 bp Região flaqueadora 50 bp 116 bp Estudos forenses Cepa 2 Primer 1 8 bp 8 bp 8 bp Primer 2 Associação com determinadas enfermidades: neoplasias Região flaqueadora ATGGGCAT ATGGGCAT ATGGGCAT Região flaqueadora 50 bp 24 bp 50 bp 124 bp 18

19 Metodologia para análise Cepa 1 Cepa bp 124 bp Bricker et al. (2003) Visualização do produto amplificado Depende do tamanho da unidade de repetição Lócus 1 Lócus 1 ATGGGCAT ATGGGCAT ATGGGCAT ATGGGCAT ATGGGCAT Lócus 2 Lócus 2 TTGC TTGC TTGC TTGC bp AT AT AT AT AT 50 bp 110 bp 50 bp bp AT AT AT AT 50 bp 30 bp 30 bp GGCAATCGAT... GGCAATCGAT bp 108 bp 160 bp Genoma Cepa 1 Brucella abortus Genoma Cepa 2 Brucella abortus 30 bp 50 bp GGCAATCGAT bp 130 bp Lócus 3 AAT AAT AAT AAT Lócus 3 AAT AAT AAT AAT Cepas de Brucella abortus ATGGGCAT ATGGGCAT ATGGGCAT TTGC cepa 1 cepa 2 ATGGGCAT ATGGGCAT TTGC TTGC TTGC Locus 1 Locus 2 Rastreamento do genoma para identificação de microssatélites Tandem Repeats Finder ( Número de alelos em cada lócus VNTR analisado Cepa de Brucella Lócus 1 Lócus 2 Cepa Cepa Bancos de dados internacionais 19

20 Vantagens Alto poder discriminatório (Le Fleche et al.,2006) Espécie de Brucella Número de genótipos B. canis (n = 17) 8 B. abortus (n = 52) 41 B. suis (n = 117) 99 B. melitensis (n = 42) 33 B. ovis (n = 24) 19 Desvantagens Caracterização: amplificação de vários sítios microssatélites Brucella: 15 microssatélites Escolha dos sítios microssatélites que permitam a identificação adequada da característica desejada Comparação de resultados obtidos entre diferentes laboratórios Desvantagens Estabilidade dos microssatélites Isolados mantidos em laboratório Variabilidade no número de repetições após repiques sucessivos Desvantagens Shadow bands Utilização Caracterização de isolados de campo de Brucella abortus (Bricker et al 2003) Rastreamento epidemiológico: cepas com padrões iguais = origem comum 22 isolados de campo B. abortus provenientes de 10 rebanhos bovinos e 4 reservatórios silvestres (bisões e alces) (Bricker et al 2003) Relação entre isolados Localização geográfica Isolados provenientes do mesmo rebanho: padrão semelhante Padrões únicos para cada rebanho Amostras de B. abortus isoladas de bisões e alces: padrões únicos

21 Epidemiologia Molecular Conceitos e definições Objetivos Exemplos de estudos Giardia intestinalis Toxoplasma gondii Sarcocystis spp Epidemiologia Molecular Conceitos e definições Epidemiologia Molecular Epidemiologia molecular não trata apenas de questões taxonômicas, filogenéticas ou de genética de populações, mas da aplicação destas áreas de conhecimento em questões epidemiológicas Epidemiologia Molecular Epidemiologia Molecular Técnicas moleculares NÃO substituem métodos convencionais (consagrados). Apenas tem maior poder de resolução pois permitem a identificação de maior número de caracteres 21

22 Epidemiologia molecular X Objetivos Traços geneticamente adquiridos que variam entre indivíduos Itens de uma seqüência gênica ou protéica que variam entre indivíduos Identificação de grupos genéticos Correlações entre genótipo e fenótipo Reconstruções de histórias evolutivas Inferências de rotas de migração Identificação de grupos genéticos Identificação de grupos genéticos Correlações entre genótipo e fenótipo Reconstruções de histórias evolutivas 22

23 Inferências de rotas de migração Objetivos: marcadores moleculares Itens de uma seqüência gênica ou protéica que variam entre indivíduos Diferentes regiões do genoma = diferentes taxas de mutação marcadores moleculares Variação de sequência gênica SNPs, inserções, deleções Genes nucleares (ribossômicos, constitutivos, estruturais) Introns Genes extra nucleares (mitocôndria e outras organelas com genoma próprio) Variação de sequência gênica SNPs, inserções, deleções 23

24 Proteína capsídeo Calicivírus felino Variação de sequência gênica Variação de sequência gênica Variação de sequência gênica Variação de sequência gênica 24

25 Marcadores para identificação de gênero de microrganismos Regiões conservadas entre diversos indivíduos do gênero do microrganismo de interesse Variabilidade quando comparadas com outros gêneros de microrganismos Giardia spp.: caracterização molecular Marcadores para discriminação de espécies dentro de um gênero de microrganismo Variáveis quando se compara indivíduos de diferentes espécies Conservadas entre diferentes cepas de uma mesma espécie Marcadores para discriminação de indivíduos dentro de uma espécie de microrganismo Variáveis quando se compara indivíduos de diferentes espécies forma ativa: divisão binária flagelada: móvel disco adesivo: adesão às células intestinais 25

26 Giardia spp.: fase parasitária Giardia spp.: ciclo de vida desenvolvimento clínico assintomáticos Encistamento: na luz intestinal, após soltar-se dos enterócitos cistos eliminados com as fezes ou sintomáticos Giardia spp.: taxonomia Giardia spp.: taxonomia + 40 espécies nomeadas de acordo com o hospedeiro: G. canis, G. bovis, G. caprae, etc. FILICE (1952) 3 grupos distintos de acordo com o formato dos corpos medianos: G. agilis G. muris G. duodenalis (G. intestinalis ou G. lamblia) Giardia spp.: taxonomia Giardia duodenalis: diversidade tpi gdh 16S β-giardin ef-1a 26

27 cães felídeos humanos + animais humanos humanos + animais Giardia duodenalis: diversidade Giardia duodenalis: diversidade Grupos genotípicos assemblages Hospedeiro Assemblage A (Grupo I) Humanos e outros mamíferos: Zoonótico Assemblage A (Grupo II) Principalmente humano: Zoonótico (?) Assemblage B Humanos e outros mamíferos: Zoonótico Assemblage C/D Cães: G. canis Assemblage E Ungulados : G. bovis Assemblage F Gatos: G. felis Tipo A Tipo B Tipo C Tipo A Tipo B Tipo C? 27

28 Toxoplasma gondii: genética evolutiva Evolução clonal x Evolução panmítica Depende de atividade sexual do parasito Isolamento do parasito: clonalidade epidêmica Tipo A Tipo B Tipo C Tipo A Tipo B Tipo C Tipo A x B Tipo B x C Tipo A x C Aplicações em Epidemiologia Rastreabilidade Dinâmica de infecções 28

29 Caracterização molecular de isolados de Sarcocystis spp. obtidos de fezes de marsupiais do gênero Didelphis pela análise de fragmentos gênicos de seqüências codificadoras de antígenos de superfície dos parasitos Esquema simplificado do ciclo de vida dos protozoários do gênero Sarcocystis. Gamogonia (fase sexuada) e esporogonia são etapas que ocorrem exclusivamente nos hospedeiros definitivos, enquanto a merogonia (fase assexuada) acontece apenas nos hospedeiros intermediários. A análise das seqüências gênicas obtidas gerou os seguintes resultados: SAG-2: 279 nucleotídeos e 8 alelos para 26 amostras SAG-3: 357 nucleotídeos e 7 alelos para 21 amostras SAG-4: 279 nucleotídeos e 12 alelos para 25 amostras amostra sag2 sag3 sag4 grupo 3 IIc III # 7 Ia2 # IIa 11 Ia2 # IId 13 IIc # # 18 # # IIa 24 # deg # # deg 26 Ia1 # Ib1 36 IIc # deg Ic3 2 Ia1 III Ic1 10 Ia1 III Ib2 28 Ia1 III Ib1 22 IIc III III 4 IIc III Ic3 21 IIc III Ic2 32 IIc III Ic3 33 IIc III Ic3 34 IIc III Ic3 19 Ia2 III IId 29 III III IIa 31 IIa III IIc 16 Ia2 IIa IId 27 Ia1 IIa Ic3 17 Ia1 IIc IIa 23 Ia1 IIc IIa 25 Ia1 IIc IIa 30 Ia1 IIc IIa Sfa IIb IIb IIb 37 Ib Ia2 Ia2 38 Ib Ia2 Ia2 Sne Ic Ia1 Ia1 Sne Ic Ia3 # 0 amostra sag2 sag3 sag4 grupo 3 IIc III # 7 Ia2 # IIa 11 Ia2 # IId 13 IIc # # 18 # # IIa 24 # deg # # deg 26 Ia1 # Ib1 36 IIc # deg Ic3 2 Ia1 III Ic1 10 Ia1 III Ib2 28 Ia1 III Ib1 22 IIc III III 4 IIc III Ic3 21 IIc III Ic2 32 IIc III Ic3 33 IIc III Ic3 34 IIc III Ic3 19 Ia2 III IId 29 III III IIa 31 IIa III IIc 16 Ia2 IIa IId 27 Ia1 IIa Ic3 17 Ia1 IIc IIa 23 Ia1 IIc IIa 25 Ia1 IIc IIa 30 Ia1 IIc IIa Sfa IIb IIb IIb 37 Ib Ia2 Ia2 38 Ib Ia2 Ia2 Sne Ic Ia1 Ia1 Sne Ic Ia3 # 0 29

30 amostra sag2 sag3 sag4 grupo 3 IIc III # 7 Ia2 # IIa 11 Ia2 # IId 13 IIc # # 18 # # IIa 24 # deg # # deg 26 Ia1 # Ib1 36 IIc # deg Ic3 2 Ia1 III Ic1 10 Ia1 III Ib2 28 Ia1 III Ib1 22 IIc III III 4 IIc III Ic3 21 IIc III Ic2 32 IIc III Ic3 33 IIc III Ic3 34 IIc III Ic3 19 Ia2 III IId 29 III III IIa 31 IIa III IIc 16 Ia2 IIa IId 27 Ia1 IIa Ic3 17 Ia1 IIc IIa 23 Ia1 IIc IIa 25 Ia1 IIc IIa 30 Ia1 IIc IIa Sfa IIb IIb IIb 37 Ib Ia2 Ia2 38 Ib Ia2 Ia2 Sne Ic Ia1 Ia1 Sne Ic Ia3 # 0 amostra sag2 sag3 sag4 grupo 3 IIc III # 7 Ia2 # IIa 11 Ia2 # IId 13 IIc # # 18 # # IIa 24 # deg # # deg 26 Ia1 # Ib1 36 IIc # deg Ic3 2 Ia1 III Ic1 10 Ia1 III Ib2 28 Ia1 III Ib1 22 IIc III III 4 IIc III Ic3 21 IIc III Ic2 32 IIc III Ic3 33 IIc III Ic3 34 IIc III Ic3 19 Ia2 III IId 29 III III IIa 31 IIa III IIc 16 Ia2 IIa IId 27 Ia1 IIa Ic3 17 Ia1 IIc IIa 23 Ia1 IIc IIa 25 Ia1 IIc IIa 30 Ia1 IIc IIa Sfa IIb IIb IIb 37 Ib Ia2 Ia2 38 Ib Ia2 Ia2 Sne Ic Ia1 Ia1 Sne Ic Ia3 # 0 FIM 30

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