Aula 6: Marcadores Moleculares

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO PÓLO AVANÇADO DE XERÉM GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA CURSO MELH. GEN. E OGMs (XBT353) TURMA 2014/2 Aula 6: Marcadores Moleculares Prof. Dr. Silas Pessini Rodrigues Rio de Janeiro, 16 de setembro de 2014

2 Marcador Genético Marcadores nos cromossomos pontos de referência para a localização de genes de interesse Um bom marcador fácil observação localizado o mais próximo possível de um gene(s) de interesse, cuja observação seja mais difícil. Gene de interesse Marcador Embora fisicamente associado ao(s) gene(s) de interesse o marcador não afeta a característica codificada pelo gene. Associação entre os marcadores moleculares + genes que codificam cacterísticas de interesse = aumentam a velocidade de programas de melhoramento

3 Tipos de marcadores genéticos 1) Marcadores morfológicos Manifestam-se como fenótipos nos adultos produto da interação entre genes x ambiente Menos utilizados no melhoramento porque não existem muitos marcadores disponíveis são influenciados pelo ambiente dependem do estágio do ciclo de vida para serem utilizados Em plantas cultivadas mais comuns (milho, trigo etc.) os genes que conferem estas características são conhecidos e mapeados Ex.: formato da semente, cor da flor e hábito de crescimento 2) Marcadores moleculares Manifestam-se no nível sub-celular antes do estágio adulto do indivíduo São analisados por métodos químicos

4 Características desejáveis em um marcador molecular Revelar alto grau de polimorfismo Revelar polimorfismos de alta frequência no genoma Distribuição aleatória no genoma Seletivamente neutro Baixa taxa de mutação Fácil e rápido de ser isolado Reprodutivo Passível de automação Informação de fácil manejo/interpretação Nenhuma estratégia atende a todos estes critérios depende da aplicação e do recurso disponível

5 Quando os marcadores moleculares são utilizados? 1) Caracterização do material utilizado no melhoramento Caracterização de germoplasmas Desenvolvimento de mapas de ligação Identificação de padrões heteróticos aqueles que ocorrem em indivíduos híbridos Permite a melhor seleção dos parentes para melhoramento escolhe-se parentes que são mais complementares ao nível genético São especialente interessantes na identificação de marcadores que co-segregam com QTLs (quantitative trait loci, OTLs)

6 Quando os marcadores moleculares são utilizados? 2) Permite o manejo mais rápido do gene de interesse Análise mais precisa do parente fonte do gene de interesse evita que outros genes não interessantes sejam çarreados juntos durante dos cruzamentos F2 P1 P2 x F1 x

7 Wu et al., Nature Communications Volume: 4, Quando os marcadores moleculares são utilizados? 3) Diagnóstico precoce na população alvo Detecção das característica de interesse em estágios iniciais do desenvolvimento Ex.: genes para síntese aumentada de lisina ou triptofano em milho Kafirina Proteína de armazenamento

8 Quando os marcadores moleculares são utilizados? 4) Resolução de problemas não convencionais Possibilidade de resolver problemas clássicos de melhoramento, que o método tradicional não consegue resolver Ex.: quando o gene carreado junto com o gene de interesse é recessivo ou a ligação dele com o gene de interesse é muito próxima ele é mantido mesmo após diversos ciclos de cruzamento. Ex.: genes de resistência a doença Ex.: J.P.A. Jansen induziu resistência de alface contra o afídeo Nasanovia ribisnigi utilizou marcadores para a detecção de indivíduos que carreavam recombinação na vizinhança do gene

9 Quando os marcadores moleculares são utilizados? 5) Pirâmide de genes Capacidade de se concentrar genes de resistência a doencas múltiplas os marcadores podem ser utilizados para se obter esta resitência de forma mais rápida

10 Quando os marcadores moleculares são utilizados? 6) Identificação do cultivar vegetal Importante na proteção de propriedade intelectual Altenticação de cultivares Ex.: as setas indicam perfís únicos de amplificação do locus STM0030 de batata podem agora ser utilizados na diferenciação destes cultivares Rosa et al., Pesq. agropec. bras. vol.45 no.1 Brasília Jan. 2010

11 Polimorfismo genético Frequência e ocorrência simultanes de genótipos variantes em um população Como marcador, o polimorfismo é definido como ocorrência de mais que um alelo ou marcador genético no mesmo locus cuja menor frequência sejá >1% na população Geralmente ocorrem em regiões não codificadoras do DNA seletivamente neutros não apresentam limites de tamanho, ou são afetados por qualquer fator ambiental São muito comuns em populações naturais Podem ser detectados por eletroforese exemplo das aloenzimas com variações no padrão eletroforético Causas do polimorfismo: mutações no DNA (mutações pontuais), rearranjos cromossomais (inserção ou deleção), erros na replicação de DNA repetido em tanden Polimorfismo mais comum resulta de uma variação em um único par de base SNP (single nucleotide polymorphism) Dependendo do evento pode causar alteração no tamanho do fragmento de DNA polimorfismo pelo tramanho do fragmento

12 Marcadores baseados em enzimas Mostram variações no produto protéico da tradução o tamanho dos fragmentos por mobilidade eletroforética Iso-enzima (ou isoforma) tem pequenas variações na sequência de aminoácidos mas continuam promovendo as mesmas reações químicas diferentes isoformas de uma enzima podem ter substratos, propriedades regulátórias e Km diferentes os genes codificantes se localizam-se em locos diferentes Aloenzimas variantes da mesma enzima cujos genes estão presentes no mesmo locus geralmente codificam funções conservadas entre reinos de seres vivos as variações na sequência de aminoácidos não afetam o sítio ativo da proteína muito utilizadas em filogenia é um tipo de isoforma, mas que ocorre no mesmo locus Monômeros uma única cadeia polipetídica Multímero um agregado de cadeias polipetídicas em indivíduos heterozigotos homômeros e heterômeros serão observados

13 Marcadores baseados em enzimas Ex.: Uso de eletroforese 2-D e DIGE na descoberta de novas isoformas de proteínas envolvidas na resposta de papaya a viroses Rodrigues et al., Proteomics 2011, 11, 1 11

14 Marcadores baseados em enzimas Limitações: -Ocorrem apenas em alguns cromosomos - Número reduzido de isoformas enzimáticas conhecidas em plantas -Isoenzimas são sensíveis ao tipo/idade de tecidos Ex.: Fosfatase ácida-1 x gene de resistência a nematóide (Mi) Cap G.B. & Roberts P.A. Electrophoresis May;13(5):295-9.

15 Marcadores baseados na digestão do DNA com enzimas de restrição e hibridização de DNA com sondas marcadas: RFLP e Minissatélites

16 RFLPs (restriction fragment length polymorphism) Descoberta e isolamento de enzimas de clivagem de DNA enzimas de restrição clivam moléculas de DNA em sequências únicas, gerando fragmentos de tamanho definido os variantes são detectados quando mutações ocorrem no sítio de restricão da enzima causa o surgimento de fragmentos de tamanhos diferentes Desafio técnico necessário ter uma sonda de hibridização apropriada para o polimorfismo em questão sonda usada em southern-blot para detecção do polimorfismo Sondas podem ser provenientes bibliotecas de DNA genômico, cdna, ou minisatélites de outros organismos

17 Restriction fragment length polymorphism

18 Exemplo de um resultado de uma análise por RFLP

19 Análise do DNA mitocondrial de genótipos de arroz utilizando-se RFLP Fragmentação do DNA mitocondrial com enzimas de restrição Souther-Blot utilizandose uma sonda para DNA mitocondrial Dendograma mostrando o relacionamento entre o DNA mitocondrial de 11 genótipos de arroz

20 RFLPs (restriction fragment length polymorphism) Vantagens: Permite a detecção de variações que ocorrem em regiões codificantes ou não do DNA RFLPs têm distribuição aleatórea no genoma podem ocorrer em ambos, exons e íntrons Uma das melhores ferramentas para mapeamento do genoma de plantas Desvantagens É caro e dificil de fazer em larga escala Sequência utilizada como sonda tem que sre conhecida Poucos variantes genômicos foram sequenciados não se sabe qual é a variação responsável pelo polimorfismo Requer muito DNA para a digestão e southern-blot Muito trabalhoso e requer muito tempo de interpretação

21 Marcadores de minisatélites Minisatélites repetições de sequências nucleotídicas (10-60 bp, as vezes até 100 bp) com base no comprimento das sequências repetidas Também chamados de VNTRs (variable number of tandem repeats) Comuns em genomas eucarióticos ocorrem de 30-90% do genoma Repetições tendem ser ricas em C e G Possuem uma sequência básica GGGCAGGANG, N pode ser qualquer base Surgem de duplicações ou deleções Podem ocorrer tanto em sequência quanto dispersos no genoma (mais comum) DNA é digerido por enzimas de restrição seguido de hibridização Revela um número muito grande de polimorfismos

22 Análise de minisatélites

23 Marcadores baseados na amplificação do DNA por PCR: Microssatélites, RAPD, AFLP e SNP

24 PCR = Reação em cadeia da polimerase

25 Métodos baseados em PCR 1. Microsatélites 2. Repetições de sequência internas simples 3. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) 4. Fingerprint de DNA 5. Amplificação de regiões caracterizadas 6. Amplified fragment length polymorphism (AFLP) 7. Single nucleotide polymorphism (SNP)

26 1) Microsatélites Sequências de DNA repetitivo semelhantes mas menores que os minisatélites 2-6 pb Repetições podem ser bi-, tri- ou tetra-nucleotídeo (Ex.: GT, GAC, GACA) Genoma de cloroplastos podem ter repetições do mesmo nucleotídeo (Ex.: AA) Número de cópias varia de fonte de polimorfismo em plantas ocorrem com frequência alta e distribuição aleatória no genoma Possuem alta variabilidade, porque são mais suceptíveis à mutações Geralmente possuem muitos alelos em cada locus permite que a análise do genótipo de cada variedade seja informativo (determinar a origem parental de cada alelo) Primeiro método baseado em PCR utilizado Sequência de DNA vizinhas aos microsatélites são muito conservadas, os primes são desenhados para estas áreas primes podem ser utilizados em mais de uma espécie quando elas são próximas A alta suceptibilidade a erros durante a amplificação pode levar a artefatos da técnica (fragmentos não esperados) A possível falha na amplificação pode levar à não observação de determinados alelos complica/impossibilita a interpretação

27 Diferenciação entre cultivares de Lotus corniculatus utilizando-se microsatélites Alem et al., Cien. Inv. Agr. 38(3): Lotus corniculatus Caixa vermelha = bandas de microssatélite específicas para o cultivar San Gabriel

28 2) Repetições de sequência internas simples São regiões genômicas que ocorrem entre dois minisatélites Os primers reconhecem regiões tanto 3 quanto 5 a amplificação é extendida para que a região intermediária seja amplificada A diversidade de sequências para esta análise é menor do que aquela feita nos minisatélites As repetições podem ser conservadas ou não limita sua aplicação na distinção entre indivíduos Técnica simples e fácil

29 3) Random amplified polymorphic DNA (RAPD) DNA genômico total é amplificado utilizando-se primers randômicos nucleotídeos representam todas as possíveis combinações de bases anelam aleatoriamente no genoma O uso de primers curtos afeta a reprodutibilidade do RAPD Não requer conhecimento prévia da sequência genômica do organismo alvo utiliza sequências arbitrárias no alvo Somente sequências complementares ao primer serão reconhecidas e amplificadas se uma mutação ocorrer no local de reconhecimento altera o padrão de bandas Sucesso depende da seleção das sequências de primers corretas Dependente da concentração de DNA molde, parâmetros do PCR muito difíceis de serem reproduzidos Utiliza-se apenas as bandas reprodutivas para identificação Quando os progenitores são incluídos permite a determinação da origem dos fragmentos Técnica simples e rápida A banda diferente do gel pode ser isolada amplificada clonagem e sequenciamento

30 Resultado de RAPD de diferentes genótipos de arroz Oriza sativa

31 4) Fingerprint de DNA É uma variação do RAPD utiliza-se primers muito pequenos (5-8 pb) revela maior variabilidade Muito usado para organismos bastante próximos geneticamente a maior variabilidade revelada permite distinguí-los (Ex.: permite diferenciar um cultivar OGM do seu antecessor) Menos efetivo na difereciação de plantas cuja distância taxonômica/genética é muito grande A técnica pode ser optimizada digerindo o DNA genômico optimizando-se as condições do PCR

32 5) Amplificação de regiões caracterizadas Sequencia-se as extremidades dos fragmentos amplificados no RAPD sequência são utilizadas para a obtenção de primers mais longos (22-24 pbs) estes primers (regiões caracterizadas) utilizadas em experimentos adicionais Apresenta maior reprodutibilidade comparado ao RAPD

33 Obtenção de marcadores baseados em regiões pré-caracterizadas por RAPD Variantes de milho apresentavam características diferentes (altura, quantidade e tamanho de ramos, número de linhas com sementes nas espigas, etc.) analisados por RAPD foram gerados primers com base nos fragentos do RAPD os fragmentos específicos são amplificados de froma mais reprodutiva utilizando-se primers mais longos/melhores condições de PCR Todos os clones resultavam na amplificação de um fragmento de 1050 pb exceto o clone A188 provavelmente como resultado de uma deleção

34 6) Amplified fragment length polymorphism (AFLP) É a amplificação aleatória dos fragmentos gerados no RFLP Os primers anelam perfeitamente nas sequências alvo os síteos adaptadores de restrição das enzimas utilizadas no RFPL Primers nucleotides conferem reprodutibilidade São robustos, confiáveis, resistentes à pequenas variações no PCR Revela uma alta densidade de marcadores Um perfil de AFLP possui em média bandas ~80% pode servir como marcador Não requer conhecimento prévio da sequência genômica do organismo de interesse Não requer nenhuma coleção de sondas de hibridização para southern-blot Aplicáveis a organismos próximos

35 Distanciamento genético entre duas espécies de gramíneas Cynodon transvaalensis Perfil AFLP de diferentes genótipos para as duas espécies Árvore com os coeficientes de similaridade entre as variedades testadas Wu et al., Vol. 45 No. 3, p , 2005.

36 7) Single nucleotide polymorphism (SNP) Modificação de um único par de base no genoma que é diferente entre dois organismos São os marcadores mais abundantes e distribuídos no genoma Ocorrência varia entre espécies (1 SNP/20 pb em trigo, 1 SNP/1000 pb em humanos) Ocorrem mais em regiões não codificantes estão normalmente próximos a genes Podem ou não ter efeito fenotípido A molécula de DNA 1 difere da molécula 2 em um par de base polimorfismo C/T

37 Single nucleotide polymorphism (SNP) Analisados através de sequenciamento genômico completo, ou pela análise de ESTs (expressed sequence tags) SNPs são menos mutáveis, comparados com outros marcadores (Ex.: microsatélites) estáveis o suficiente para serem utilizados em estudos evolucionários, análise da estrutura de populações, identificação de cultivares Técnica mais cara e leva tempo

38 Nenhuma estratégia atende a todos estes critérios desejáveis de um marcador molecular depende da aplicação e do recurso disponível