Marcadores Genéticos. Qualquer característica morfológica ou molecular que diferencia indivíduos, e que seja facilmente detectável
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- Maria Fernanda di Azevedo Imperial
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1 Marcadores Genéticos Qualquer característica morfológica ou molecular que diferencia indivíduos, e que seja facilmente detectável
2 Marcadores Morfológicos É um fenótipo de fácil identificação, normalmente determinado por um único alelo. Características fenotípicas são utilizadas como marcadores morfológicos desde os tempos de Mendel, como fenótipos de fácil identificação visual
3 MarcadoresBioquímicos(moleculares) Baseado na propriedade de migração das proteínas, as quais podem ser separadas por eletroforese;
4 Marcadores de DNA (moleculares) Polimorfismo detectado na seqüência de DNA Vantagens: - Não é objeto de influências ambientais; - Potencialmente ilimitado em número; Maior desvantagem é a necessidade de técnicas e equipamentos mais complexos.
5 Características Desejáveis alto polimorfismo; reprodutibilidade; amplamente distribuído através do genoma; discriminação; ausência de influências ambientais; barato; fácil de mensurar
6 Tipos de marcadores Hibridação RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Minissatélites VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) Amplificação de DNA RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions) ou ASA (Amplified Specific Amplicon) Microssatélites SSR (Simple Sequence Repeats) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
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9 RAPD
10 Polimorfismo de DNA entre indivíduos pode ser devido a: Ausência do sítio do primer. Surgimento de um novo sítio. Ao comprimento da região amplificada entre sítios de primer SNPs**
11 Microssatélites SSR (Simple SequenceRepeats) Significa Seqüências Simples Repetidas, a qual consiste de pequenas seqüências de nucleotídeos (1 a 4) repetidas em tandem. Essas seqüências são distribuídas ao acaso no Essas seqüências são distribuídas ao acaso no genoma e constituem a classe de marcador mais polimórfica hoje disponível
12 Primers específicos (20 a 30 pb). Diferentes números de elementos simples repetidos. Cada segmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo diferente do mesmo loco Requer biblioteca de fragmentos genômico para o organismo de interesse
13 Genótipos na eletroforese
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15 SNPs A Single Nucleotide Polymorphism, ou SNP ("snip"): pequena mudança, ou variação, que pode ocorrer numa sequência de DNA em uma porção significativa (mais de1%)deumapopulação.
16 Single Nucleotide Polymorphism SNPs são as mais frequentes formas de variações genéticas 90% das variações genéticas humanas vêm dos SNPs SNPs ocorrem a cada 300~600 nucleotídeos SNPs tem se tornado marcadores de preferência pela sua grande abundância e pelo desenvolvimento de tecnologias de genotipagem em larga escala
17 Single Nucleotide Polymorphism SNPs são alterações no DNA que se mantém nas gerações futuras SNP: variação >1% Mutação: variação <1% 94% C T T A G CT T 99.9% C T T A G CT T 6% C T T A G TT T 0.1% C T T A G TT T SNP Mutação
18 De onde vem essas variações? variações nas sequências são resultados de mutações TAAAAAT SNPs foram mutações que se propagaram ao longo de gerações TAAAAAT TAAAAAT TAACAAT TAACAAT TAAAAAT TAAAAAT TAACAAT TAACAAT TAACAAT
19 Mutações and SNPs SNPs Mutações Variações genéticas observadas Ancestral comum tempo presente
20 Classificação de SNP Codificantes Sinônimas podem modificar a estrutura e a estabilidade do RNA mensageiro conservativas Nãocodificantes Nãosinônimas Nãoconservativas
21 Aplicações dos SNPs Genotipagem -padrões de SNP Pesquisas em desenvolvimentos de drogas São marcadores para identificar genes e diferenças genéticas que podem determinar a resposta de pacientes a uma doença ou tratamento. Descoberta e mapeamento de genes Diagnóstico ou perfil de risco Encontrar o par perfeito
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23 Encontrando SNPs: Mineração de SNPs baseados no sequenciamento mrna Genomic cdna Library EST Overlap Sequenciamento De DNA BAC Library BAC Overlap RRS Library Shotgun Overlap
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25 Encontrando SNPs: Mineração de SNPs baseados no sequenciamento DNA from multiple individuals Fragment DNA Sequence and Reassemble (known sequence) Assembly with other overlapping GTTACGCCAATACAGGATCCAGGAGATTACC GTTACGCCAATACAGCATCCAGGAGATTACC From overlap identify mismatches = SNPs
26 Amplificação do DNA 5 3 Sequenciamento Phred Phrap Base-calling Contig assembly Vários indivíduos PolyPhred Polymorphism detection Consed Sequence viewing Polymorphism tagging Analysis Relatório de polimorfismos Genotipagem individual Análise filogenética
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28 Homozigoto C/C Heterozigoto C/T Homozigoto T/T
29 Etapas do PolyBayes Alinhamento multiplo ancorando os fragmentos na sequência de referência Filtro de parálogos: excesso de mismatchs levando em conta os valores de qualidade Detecção de SNPs -> diferença entre verdadeiros polimorfismos e erros de sequenciamento utilizando valores de qualidade
30 Identificação de SNPs com o QualitySNP Análise das informações do agrupamento Detecção dos SNPs (todos os SNPs potenciais bi, tri e tetra alélico) Filtro dos dados Detecção dos haplótipos Detecção dos SNPs sinônimos e não sinônimos com o fasty (blastx) Identificação do KaKs Geração dos dados e transferência para um banco de dados Interface para recuperação dos dados
31 Reconstrução dos Haplótipos com o qualitysnp Grupo de sequências num cluster que representa o mesmo alelo de um gene Tem o mesmo nucleotídeo no sítio polimórfico Utiliza métodos matemáticos para minimizar falsas contruções de haplótipos causados por erro de sequenciamento
32 Identificação dos SNPs sinônimos e nãosinônimos Fasty para alinhamento com o UNIPROT Permite frameshifts entre os códons Produz melhores alinhamento com sequências de qualidade ruim Seleciona primeiro hit Detecta a ORF Corrige possíveis frameshifts Detecta ssnp/nssnp e SNPs ou INDELs em região UTR
33 haplótipos -A CT T TG C T C- Haplotype 1 C T C -A CT T AG C T T- -A AT T TG C T C- Haplotype 2 Haplotype 3 C A T A T C SNP 1 SNP 2 SNP 3 SNP 1 SNP 2 SNP 3
34 Blocos de haplótipos Dentro de um bloco haplótipo, acontece pouca ou nenhuma recombinação Os SNPs dentro de um bloco haplótipo tendem a ser passados juntos nas gerações posteriores Dentro de um bloco haplótipo, um pequeno subconjunto de SNPs (Tag SNPs) é suficiente para distinguir cada haplótipo Então será preciso utilizar apenas os Tag SNPs para genotipar ao invéz de usar todos os SNPs no bloco haplótipo
35 Zonasde recombinaçãoe Blocosde haplótipos Haplotype patterns Recombination hotspots S 1 S 2 P 1 P 2 P 3 P 4 S 3 Haplotype blocks SNP loci S 4 S 5 S 6 : Major allele : Minor allele S 7 S 8 S 9 S 10 S 11 Chromosome S 12
36 Exemplos de Tag SNPs Haplotype patterns P 1 P 2 P 3 P 4 Amostra desconhecida S 1 S 2 S 3 S 4 Desejamos distinguir um haplótipo desconhecido Podemos genotipar todos os SNPs para identificar a amostra desconhecida SNP loci S 5 S 6 S 7 S 8 S 9 S 10 S 11 : Major allele : Minor allele S 12
37 Examples of Tag SNPs Haplotype pattern S 1 S 2 S 3 S 4 P 1 P 2 P 3 P 4 Não é necessário genotipar todos os SNPs SNPs S 3, S 4, e S 5 podem formar um grupo de tag SNPs. SNP loci S 5 S 6 S 7 P 1 P 2 P 3 P 4 S 8 S 9 S 10 S 3 S 4 S 5 S 11 S 12
38 Exemplos de Tag SNPs errados Haplotype pattern P 1 P 2 P 3 P 4 S 1 S 2 S 3 S 4 SNP S 5 S 6 loci P 1 P 2 P 3 P 4 S 7 S 8 S 9 S 10 S 11 S 12 S 1 S 2 S 3
39 Exemplos de Tag SNPs Haplotype pattern S 1 S 2 S 3 S 4 P 1 P 2 P 3 P 4 SNPs S 1 e S 12 podem formar um conjunto de tag SNPs Este é o menor conjunto de SNP nesse exemplo SNP loci S 5 S 6 S 7 S 8 P 1 P 2 P 3 P 4 S 9 S 10 S 11 S 1 S 12 S 12
40 Taxa de Evolução Para inferir uma taxa de evolução a um gene são estimados o KA e o KS KA -é a relação entre substituições não sinônimas e todos os possíveis sitios não sinônimos KS é a relação entre substituições sinônimas e todos os possíveis sítios sinônimos
41 Exemplo: Prolina: CCT CCA CCG CCC Um sítio sinônimo e dois não sinônimos
42 KA/KS (dn/ds) A taxa KA/KS é uma medida clássica da evolução de maneira global num gene KA/KS << 1 indica que uma substancial proporção de mudanças de aminoácidos devem ter sido eliminadas por seleção de purificação. KA/KS > 1 indica seleção adaptativa ou positiva
43 A taxa de KAKS em humanos e chimpanzes é de 0,23. Assumindo que mutações sinônimas são neutras, esse resultado implica que 77% das alterações de aminoácidos em genes hominideos são suficientemente deletérias e são eliminadas por seleção natural. Como mutações sinônimas não são totalmente neutras, a proporção de alterações de aminoácido neutras com consequências deletérias deve ser maior
44 KaKs_calculator -Métodos NG: Nei, M. and Gojobori, T. (1986) -Faster LWL: Li, W.H., et al. (1985) LPB: Li, W.H. (1993) and Pamilo, P. and Bianchi, N.O. (1993) MLWL (Modified LWL), MLPB (Modified LPB): Tzeng, Y.H., et al. (2004) YN: Yang, Z. and Nielsen, R. (2000) MYN (Modified YN): Zhang, Z., et al. (2006) GY: Goldman, N. and Yang, Z. (1994) MS (Model Selection), MA (Model Averaging): based on a set of candidate models defined by Posada, D. (2003) as follows.
45 Aula Prática Montar Ests com sequência Encontrar prováveis SNPs Visualizar cromatograma para validar e identificar homozigotos de heterozigotos Definir haplótipos Definir tag SNPs Caracterizar snsnp ou ssnp; CDS; Transição ou transversão; Desenhar sondas para separar haplotipos e genotipar
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