Introdução às Tecnologias de Sequeciamento: Sanger e Nova Geração (NGS)

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1 Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Campus de Jaboticabal Introdução às Tecnologias de Sequeciamento: Sanger e Nova Geração (NGS) Dr. Camila Cesário Fernandes LMSeq Agosto 2016

2 Definir a sequência de nucleotídeos...

3 Watson e Crick Modelos dupla hélice do DNA Maxam e Gilbert Método de degradação química

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6 Clonagem de um fragmento de DNA alvo em Escherichia coli

7 DNA FRAGMENTO ALVO PCR

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11 ABI 3130 ABI 3130 xl ABI 3500 ABI 3730 xl

12 O método Sanger permite o sequenciamento de 500 a 800, até 1000 pb, dependendo do equipamento e do material que está sendo sequenciado. Margem de erro da Taq DNA polimerase é de 1% até os primeiros 350 nucleotídeos sequenciados e de 17% acima dos 500 nucleotídeos sequenciados (Koop et al., 1993, Biotechniques); Taq DNA polimerase High Fidelity menor erro; Método laborioso e demorado; Método de clonagem requer grande quantidade de DNA genômico e nem sempre o fragmento esperado é clonado.

13 ION Torrent Illumina Pirosequenciador 454 Sanger - capilar Pacific Biosciencies Nanopore

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15 O método de clonagem foi substituído pela ligação de adaptadores às extremidades do fragmento de DNA que permite a amplificação de genomas complexos com a utilização de primers comuns BIBLIOTECAS DE FRAGMENTOS

16 Emulsion PCR tecnologia empregada para o 454 (Roche), Ion Torrent (ThermoFisher Scientific) Após a ligação dos adaptadores, cada molécula de DNA (fita simples) é capturada, sob condições ideais, por uma bead (esfera) Metzker, 2010, Nature A reação consiste na mistura de uma emulsão de óleo utilizada para capturar os complexos DNA-esferas em simples gotículas aquosas

17 Após a amplificação e o enriquecimento das esferas (PCR em emulsão), as mesmas, aos milhões, podem ser depositadas em pocinhos individuais em placas PicoTiter

18 G PPi A DNA polimerase incorpora a base correta à sequência liberando pirofosfato

19 A ATP sufulrilase converte o pirofosfato em ATP na presença de adenosina 5 fosfosulfato (APS)

20 G A luz produzida na reação é detectada por uma câmera e analisada em um programa O ATP age como combustível para a conversão de luciferina em oxiluciferina mediada pela enzima luciferase, que gera uma quantidade de luz visível proporcional à quantidade de ATP

21 Nucleotídeos não incorporados e ATP são degradados pela apirase e assim, a reação pode recomeçar com outro nucleotídeo

22 Química: pirosequenciamento Bibliotecas fragmentos e mate-pair Comprimento médio de leitura: 330 bases Tempo de corrida em dias: 0,35 para 0,45 Gb ( pb) Vantagens: leituras longas possibilita o mapeamento de regiões repetitivas do DNA, curto tempo de corrida Desvantagens: alto custo de reagentes; alta taxa de erros de inserção Aplicações: sequenciamento de novo, captura de exons em média escala, 16S em metagenômica Descontinuado Metzker, 2010, Nature

23 MiSeq - Flowcell

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26 Amplicação fase-sólida (Bridge amplification): primers forward e reverse de alta densidade são covalentemente aderidos à uma lâmina de vidro. Essa amplificação pode produzir de milhões de clusters separados espacialmente, deixando uma extremidade livre para que o primer universal possa ser hibridizado a fim de se iniciar o sequenciamento

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29 Química: terminador reversível Biblioteca: fragmentos e mate-pair Comprimento médio de leitura: bases Tempo de corrida em dias: depende da biblioteca e do equipamento Adaptadores: P5 e P7 Vantagens: atualmente é uma das plataformas mais utilizadas Desvantagens: erros de substituição Aplicação: sequenciamento de novo, exoma, target resequencing, possibilita a descoberta de genes em metagenômica, expressão gênica (RNA-Seq).

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33 Química: semicondutor Biblioteca: fragmentos Comprimento médio de leitura: bases, sendo gerados de 3Mb a 2Gb Tempo de corrida: curto, em torno de 3 horas Adaptadores: A e P1 Vantagens: alta acurácia, baixo custo, rapidez Desvantagens: erros de inserção e deleção, baixo throughput Aplicação: pequenos genomas, target resequencing, diversidade metagenômica (16S rrna).

34 Química: semicondutor Biblioteca: fragmentos Comprimento médio de leitura: 200 bases, sendo gerados até 20 Gb de dados Tempo de corrida: curto, em torno de 4 horas Vantagens: alta acurácia, baixo custo, rapidez, alto throughput quando comparado ao PGM Desvantagens: erros de inserção e deleção Aplicação: sequenciamento de novo, exoma, target resequencing, possibilita a descoberta de genes em metagenômica, expressão gênica (RNA-Seq).

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36 Metzker, 2010, Nature

37 Para ajudar a entender como o PacBio funciona

38 Química: real-time Biblioteca de fragmentos, molécula única Comprimento médio de leitura: de 10 a 20Kb Vantagens: possui o maior potencial de leitura acima de 1kb Desvantagens: possui as maiores taxas de erro se comparada com as outras tecnologias de sequenciadores de nova geração Aplicação: sequenciamento completo de genomas, complementa os esforços de re-sequenciamento na descoberta de grandes variações estruturais e haplótipos.

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41 Obrigado! Contato: Tel: (16) ramal: 7970

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