DO DNA AO PRODUTO GÊNICO DNA FORENSE E CLINICO

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1 DO DNA AO PRODUTO GÊNICO DNA FORENSE E CLINICO FORS 241 Forensic DNA Profiling (3) Anderson The course introduces the student to the procedures involved in DNA profiling of evidence. This will include DNA extraction, quantitation, amplification and detection of mitochondrial DNA and short tandem repeat polymorphisms. This course is required for all forensic molecular biology students. FORS 242 Forensic Molecular Biology (3) Dawson Advanced methods of forensic molecular biology. Laboratory examinations and classifications of dried blood and other biological materials through a variety of nuclear and mitochondrial markers. Independent laboratory projects. 1

2 Um exame de DNA, feito sem o consentimento de Roberta Jamilly Martins Borges, 23, provou, segundo a polícia, que ela não é filha natural de Vilma Martins Costa, 47, mulher acusada de levar o hoje adolescente Pedrinho -registrado como Osvaldo Martins Borges Júnior- de uma maternidade, em Por meio de uma bituca de cigarro deixada por Roberta no lixo da delegacia, em janeiro deste ano, os peritos conseguiram isolar a saliva da jovem e fazer o exame. Os policiais tiveram ajuda de especialistas em genética e do Instituto de Pesquisa de DNA Forense, da Polícia Civil de Brasília. BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE -IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIMES ANIMAIS/VEGETAIS -IDENTIFICAÇÃO DE INDIVÍDUOS 2

3 IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIMES ANIMAIS DETERMINAÇÃO DO INTERVALO POST MORTEM Diferentes espécies de moscas procuram os corpos em diferentes intervalos post mortem ENTOMOLOGIA FORENSE IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIMES ANIMAIS 3

4 PCR-RFLP Factor V Leiden humano Relação com propensão a trombose profunda 4

5 IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIMES VEGETAIS O CRIMINOSO NORMALMENTE DEIXA ALGO NA CENA DO CRIME OU LEVA CONSIGO ALGUMA COISA BOTÂNICA FORENSE Plantas podem ser identificadas utilizando-se apenas 1 mm de tecido seco, 5 grãos de pólen fresco ou 10 pgramas de DNA IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIMES VEGETAIS -Caso Maricopa (Arizona - Maio de 1992) Mulher foi morta e encontrada em um depósito abandonado. Suspeito nega ter estado perto do depósito. Encontradas sementes de Maricopa no furgão do suspeito. Através de um teste de genotipagem de DNA (RAPD) as sementes foram diagnosticadas como das árvores ao redor do depósito (teste cego com várias outras amostras). 5

6 RAPD Random Amplified Polymorphic DNA Primers pequenos (x) 10 Temperatura de anelamento baixa A B -Produtos do mesmo tamanho apresentam mesmo locus gênico -Presença de produtos é um caracter dominante (AA ou Aa) 6

7 IDENTIFICAÇÃO DE INDIVÍDUOS -É necessário a utilização de regiões polimórficas de DNA. -Quanto mais locus são testados, maior a probabilidade de acerto. Para testes de paternidade e forense, até 18 locus diferentes são testados. -Normalmente são utilizados STR (short tandem repeats) STR ou microssatélites Locus específico no genoma Presença de milhares no homem Kits com microssatélites préestabelecidos 7

8 STR ou microssatélites -Regiões repetitivas de DNA (de 1 a 6 nucleotídeos) -Altamente polimórficos (polimorfismo de tamanho) -Facilmente tipados EXEMPLO: actaatctagcgggctagcttagcttaggctaatgctagctgcatgcatgcatgca tgcatgcatgcatgatctgcatgcagattttcgctccctaaccgctatagctagcgc at 8

9 STR ou microssatélites O FBI registrou 13 diferentes STR para o uso na identificação de criminosos. (CODIS Combined DNA Index System) Locus D3S1358 vwa FGA D8S1179 D21S11 D18S51 D5S818 Genotype 15, 18 16, 16 19, 24 12, 13 29, 31 12, 13 11, 13 Frequency 8.2% 4.4% 1.7% 9.9% 2.3% 4.3% 13% Locus D13S317 D7S820 D16S539 THO1 TPOX CSF1PO AMEL Genotype 11, 11 10, 10 11, 11 9, 9.3 8, 8 11, 11 X Y Frequency 1.2% 6.3% 9.5% 9.6% 3.52% 7.2% (Male) 9

10 STR ou microssatélites STR ou microssatélites Passos para a análise: 1. Extração do DNA Normalmente em testes de paternidade o DNA é extraído de células da mucosa da boca. Para estudos forense, amostras de sangue, cabelo, fragmento de pele, etc...) Quantificação 10

11 STR ou microssatélites 2. Amplificação do DNA O DNA referente a cada locus é amplificado com oligonucleotídeos específicos daquele locus. EX: actaatctagcgggctagcttagcttaggctaatgctagctgcatgcatgcatgc atgcatgcatgcatgatctgcatgcagattttcgctccctaaccgctatagctagc gcat STR ou microssatélites 11

12 STR ou microssatélites 3. Detecção do DNA amplificado Utiliza-se oligonucleotídeos fluorescentes com diferentes espectros. Normalmente são possíveis 3 marcações diferentes dos oligos mais a marcação do padrão de peso. 12

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15 EXEMPLOS DE TESTES EXEMPLOS DE TESTES 15

16 EXEMPLOS DE TESTES EXEMPLOS DE TESTES 16

17 PROBABILIDADES Locus D3S1358 vwa FGA D8S1179 D21S11 D18S51 D5S818 Genotype 15, 18 16, 16 19, 24 12, 13 29, 31 12, 13 11, 13 Frequency 8.2% 4.4% 1.7% 9.9% 2.3% 4.3% 13% Locus D13S317 D7S820 D16S539 THO1 TPOX CSF1PO AMEL Genotype 11, 11 10, 10 11, 11 9, 9.3 8, 8 11, 11 X Y Frequency 1.2% 6.3% 9.5% 9.6% 3.52% 7.2% (Male) -Neste caso as freqüências dos alelos 15 e 18 do locus D3S1358 são respectivamente e A frequencia em que se encontra um indivíduo 15,18 é: P=2pq que é igual a 2x x =.0819 (8,2%). -A probabilidade de se encontrar um mesmo indivíduo com os mesmos alelos é: P=p1 x p2 x p3..= 1.3 x Ou seja a chance de se encontrar este indivíduo é 1/ 1.3 x que é igual a 7,7 milhões de bilhões ou mais de 1 milhão a população da terra. 17

18 PCR e o diagnóstico clínico Prevenção precoce do câncer de mama genes BRCA1 e BRCA2 BRCA1 e 2 Mulheres judias com ascendência ashkenazim tem chance de 1/40 de desenvolver algum tipo de mutação. Outras mulheres tem chance de 1/500 Existem 3 entre as 150 mutações encontradas mais ligadas ao desenvolvimento do câncer Mulher com algumas destas 3 mutações tem 56% de chance de desenvolver tumores antes dos 70 anos 18

19 PCR e o diagnóstico clínico Prevenção de trombose profunda Entre 40% e 60% dos casos de trombose venosa hereditária devem-se a presença do fator V resistente a ação proteolítica da Proteína C ativada. Um estudo realizado em 1994 mostrou que uma mutação no gene do fator V causa 95% dos casos de resistência a PCA. A mutação do Fator V Leiden é encontrada em 30% a 60% dos pacientes com trombofilia hereditária e entre 3% a 7% das pessoas sadias em populações caucasianas. FATOR V LEIDEN Fig. 1 Amplificação por PCR na região do exon 10 do gene do fator V, seguida de digestão pela enzima MnlI (Biolab ), para a detecção da mutação Fator V Leiden, Visualização após eletroforese em gel de poliacrilamida 7% e coloração por brometo de etídeo. Raia 1: marcador de peso molecular fx 174 RF/Hae III digest Pharmacia ); raias 2 e 3: pacientes que não apresentaram a mutação analisada; raias 4 e 6: pacientes com a mutação Fator V Leiden em heterozigose; raia 5: paciente com a mutação Fator V Leiden em homozigose. 19

20 PCR e o diagnóstico clínico Outros diagnósticos: -PREVENÇAO A DEFEITOS DO TUBO NEURAL -PROPENSÃO A DOENÇA DE ALZHEIMER -IDENTIFICAÇÃO PRECOCE DA DOENÇA DO RIM POLICÍSTICO -PREVENÇAO A DOENÇAS CARDÍACAS PCR e o diagnóstico clínico Detecção viral HIV, hepatite B, hepatite C, etc... PCR para detecção de Leishmania chagasi PCR para detecção e genotipagem de Plasmodium falciparum Detecção de parasitas em casos assintomáticos 20