Carga Viral do HIV. Carga Viral. Falha terapêutica. Vírus suscetivel Vírus resistente

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2 Carga Viral do HIV Estima o número de cópias do genoma viral circulante no indivíduo. Expresso em número de cópias do RNA de HIV/mL. Atualmente os testes são capazes a partir de ~50 cópias/ml. O conceito de carga viral indetectável depende da metodologia empregada. Carga Viral Vírus suscetivel Vírus resistente Falha terapêutica

3 Evolução dos testes para monitoramento clínico p24 p24 p24 p24 p24 p cópias/ml cópias/ml cópias/ml p24 Antes de 1995, a evolução clínica era avaliada laboratorialmente pela detecção dos níveis de p24 circulantes no paciente, no entanto alguns pacientes não possuiam niveis detectáveis de p24 no período de latência clínica. Os testes de biologia molecular se mostraram mais eficientes para o monitoramento da evolução da doença.

4 Tratamento antirretroviral e CV O tratamento antirretroviral trouxe benefícios como a redução da morbidade e mortalidade associada à aids, melhorando a qualidade de vida das PVHA. O sucesso terapêutico do tratamento antirretroviral está diretamente relacionado aos níveis de carga viral circulantes no indivíduo. Objetivo da terapia antirretroviral Carga Viral CD4

5 Carga viral e transmissão do HIV Os níveis de carga viral estão diretamente relacionados com o risco de transmissão da infecção pelo HIV. Individuos com carga viral indetectável tem chance reduzida de transmissão. A adesão ao tratamento e o monitoramento clínico e laboratorial tem impacto direto na interrupção da cadeia de transmissão do HIV. Risco de transmissão Soroconversão Assintomático Baixa de CD4 Aids

6 Carga viral do HIV Hoje A tecnologia TaqMan é uma metodologia de PCR quantitativo (qpcr) amplamente utilizada em diagnóstico e pesquisa por diferentes empresas e instituições. O princípio do sistema TaqMan HIV-1

7 Características dos testes de carga viral disponíveis no mercado Características NucliSENS EasyQ HIV-1 v2.0 COBAS TaqMan HIV-1 RealTime HIV-1 VERSANT HIV kpcr v1.0 Fabricante biomérieux Roche Diagnostics Abbott Molecular Diagnostics Siemens Medical Solutions Metodologia Real-time NASBA Real-time RT-PCR Real-time RT- PCR kpcr Extração automatizada EasyMAG COBAS AmpliPrep M2000sp VERSANT kpcr molecular systems SP Extração manual MiniMAG QiAamp viral RNA Sample preparation system None Tipo de amostra Plasma, DBS, tissues Plasma, DBS Plasma, DBS Plasma, DBS Volume de amostra (ml) Região alvo no HIV gag gag pol (integrase) pol Sonda Molecular beacons TaqMan Partially doublestranded TaqMan probes Número de amostras por corrida Tempo de corrida (h) Faixa de detecção (HIV-RNA cópias/ml) Especificidade (%) (95% CI) 10-10,000, ,000, ,000, ,000, ( ) 100 ( ) 100 ND <40 D (>40) Subtipos do HIV detectados Group M (A-D, F-H, J) Group M (A-D, F-H; CRF01_AE) Group M (A-D, F, G, H; CRF01_AE, CRF02_AG), Group N, Group O Group M (A-D, F-H, K; CRF01_AE, CRF02_AG, CRF06_cpx), Group O

8 Point of care (POC) A evolução tecnológica permitiu o desenvolvimento de testes diagnósticos que não estão confinados ao ambiente laboratorial e são de fácil execução. Estes testes representam um novo paradigma no diagnóstico e no monitoramento clínico das doenças.

9 Carga viral do HIV: o futuro PCR em tempo real Diagnóstico infantil e Carga Viral Sangue total, Plasma e DBS 20 testes em 8 horas - Gene Xpert IV Samba I Samba II Amplificação Isotérmica Semi-quantitativo Diagnóstico infantil e Carga Viral Sangue total e Plasma 16 a 24 testes em 8 horas Amplificação Isotérmica Ensaio qualitativo (limite mínimo de 1000 cópias) Diagnóstico infantil e Carga Viral Punção Digital ou Venosa (sangue total) e Plasma 4 testes em 8 horas

10 Carga viral do HIV: o futuro PCR em tempo real Diagnóstico infantil e Carga Viral quantitativa Sangue total e Plasma cobas Liat System em desenvolvimento Alere Q PCR em tempo real qualitativo Diagnóstico infantil Punção digital e Venosa (Sangue total) e Plasma 8 testes em 8 horas Carga Viral quantitativa em teste

11 Carga viral do HIV: o futuro

12 Genotipagem do HIV Detectar a resistência genotípica (mutações do HIV) em pessoas vivendo com HIV/Aids através do teste de genotipagem possibilita a orientação do tratamento e seleção de uma terapia de resgate. Antirretroviral Bloqueio da replicação viral Variantes resistentes se Tornam predominantes Variantes do HIV sensíveis a droga Variante do HIV resistente a droga

13 O início da genotipagem do HIV O genotyping line probe assay (LiPA) foi o primeiro teste de genotipagem desenvolvido em Se tratava de um ensaio de hibridização de um produto de PCR em oligonucleotídeos imobilizados em uma tira de teste. O ensaio era capaz de identificar mutações pontuais de resistência na transcriptase reversa. No Brasil o teste de genotipagem é utilizado como política pública desde 2001.

14 Evolução da genotipagem Os primeiros passos para o seqüenciamento direto de DNA foram dados por Sanger, em A metodologia ficou conhecida como método da cadeia interrompida. Hoje o método de Sanger baseia-se na amplificação, por PCR, de fragmentos de DNA.

15 Evolução da genotipagem

16 Sistemas comerciais Trugene HIV-1 Genotyping Kit O sistema faz uso de uma metodologia de sequenciamento nucleotídico em gel de poliacrilamida. As sequencias obtidas devem ser analisadas usando um algoritmo frente a um banco de dados de sequencias para a emissão do relatório de resistência. A empresa Siemens anunciou a descontinuação da comercialização do sistema Trugene em ViroSeq HIV-1 Genotyping System Sistema comercializado pela Abbott- Diagnóstica. O ensaio contém os insumos necessários para o sequenciamento automático de amplicons do HIV-1. Os equipamentos necessários para a realização do ensaio devem ser adquiridos a parte, e incluem: termociclador, centrífuga, micropipetas e sequenciador automático ABI 3010 ou 3100

17 Sequenciamentos de última geração

18 Precisamos de tanta informação? Ainda não existem kits comerciais para a genotipagem utilizando metodologia de última geração. Com essa metodologia é possível obter o sequenciamento do genoma completo do HIV, inclusive de populações minoritárias. Ainda não há comprovação da utilidade dessa grande quantidade de dados gerados.

19 Genotipagem Rápida Engineering a Paper-Based Microfluidic Device for Genotyping HIV Drug Resistance at the Point-of- Treatment N Panpradist1, I Beck2, J Lai1, LM Frenkel1,2, BR Lutz1 1University of Washington, Washington, USA; 2Seattle Children s Research Institute, Washington, USA Dispositivo capaz de detectar uma mutação pontual no genoma do HIV, associada a resistência aos ARVs com alta sensibilidade. Como se trata de um dispositivo POC pode ser realizado fora do ambiente laboratorial

20 Futuro?Genotipagem virtual SISGENO Resultados dos exames Lista de mutações na PR e RT Data da Genotipagem Exames Geno Dados clínicos Id dos pacientes SISCEL + SICLOM Carga viral CD4 Tratamento ARV Aumento da CV no momento da Geno Novo paciente Modelo preditivo Contém regras que definirão o perfil de resistência aos ARV Resultado da genotipagem virtual

21 Obrigado!