Escolha de iniciadores. Cairé Barreto
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- Patrícia Castelo Espírito Santo
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1 Cairé Barreto 2017
2 A replicação do DNA precisa de iniciadores para acontecer (PRIMASE) A DNA polimerase replica o DNA a partir de uma fita pré-existente (5 -> 3 ). Pequenos segmentos de RNA orientam a DNA polimerase III.
3 PCR: replicação in vitro de segmentos de DNA desejados. Como dar início à síntese do segmento de DNA de interesse em um tubo? A enzima primase é adicionada à reação dentro do tubo?
4 PCR: replicação in vitro de segmentos de DNA desejados. Como dar início à síntese do segmento de DNA de interesse em um tubo? A enzima primase é adicionada à reação dentro do tubo? Ribonucleotídeos Tampões DNA primase Ribonuclease DNA polimerase I
5 PCR: replicação in vitro de segmentos de DNA desejados. Como dar início à síntese do segmento de DNA de interesse em um tubo? A enzima primase é adicionada à reação dentro do tubo?
6 Primers de DNA flanqueiam a região de interesse e demarcam o amplicon. Amplificação específica! Kary B. Mullis Fonte: Fonte: Biologia Molecular da Célula, 5ª Edição.
7 Pequenos segmentos sintéticos feitos de ssdna! 5 3 P P P P P P P P P OH A T C A G C G T T
8 Pequenos segmentos sintéticos feitos de ssdna! Oligonucleotídeos (oligos: poucos): usualmente entre 18 e 23 nucleotídeos. Maior estabilidade térmica. Simplificação do processo de replicação in vitro.
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10 Tá, mas de onde é que vêm esses oligonucleotídeos de DNA?
11 Os iniciadores são desenhados por nós, pesquisadores! A sequência dos iniciadores é escolhida de acordo com o segmento de DNA de interesse.
12 Os iniciadores são desenhados por nós, pesquisadores! A sequência dos iniciadores é escolhida de acordo com o segmento de DNA de interesse. A T C G 25 C
13 Os iniciadores são desenhados por nós, pesquisadores! A sequência dos iniciadores é escolhida de acordo com o segmento de DNA de interesse. A T C G 95 C
14 Os iniciadores são desenhados por nós, pesquisadores! A sequência dos iniciadores é escolhida de acordo com o segmento de DNA de interesse. A T C G 60 C
15 Os iniciadores são desenhados por nós, pesquisadores! A sequência dos iniciadores é escolhida de acordo com o segmento de DNA de interesse. A T C G 60 C
16 Os iniciadores são desenhados por nós, pesquisadores! A sequência dos iniciadores é escolhida de acordo com o segmento de DNA de interesse. A T C G 60 C
17 Os iniciadores são desenhados por nós, pesquisadores! A sequência dos iniciadores é escolhida de acordo com o segmento de DNA de interesse. Os iniciadores definem qual a região do DNA que será amplificada. Álcool Desidrogenase(ADH) DNA complementar (cdna)
18 Os iniciadores são desenhados por nós, pesquisadores! A sequência dos iniciadores é escolhida de acordo com o segmento de DNA de interesse. Os iniciadores definem qual a região do DNA que será amplificada. Álcool Desidrogenase(ADH) DNA complementar (cdna)
19 Os iniciadores são desenhados por nós, pesquisadores! A sequência dos iniciadores é escolhida de acordo com o segmento de DNA de interesse. Os iniciadores definem qual a região do DNA que será amplificada. Álcool Desidrogenase(ADH) DNA complementar (cdna)
20 Os iniciadores são desenhados por nós, pesquisadores! A sequência dos iniciadores é escolhida de acordo com o segmento de DNA de interesse. Os iniciadores definem qual a região do DNA que será amplificada. Álcool Desidrogenase(ADH) DNA complementar (cdna)
21 Como escolhê-los? ACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCATGCATGCTA TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGTACGTACGAT 3
22 Como escolhê-los? 3 5 ACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCATGCATGCTA 5 TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGTACGTACGAT 3
23 Como escolhê-los? 3 5 ACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCATGCATGCTA 5 TAGATCTCGATCGTTCGA TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGTACGTACGAT 3
24 Como escolhê-los? ORIENTAÇÃO DOS INICIADORES: 5 -> ACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCATGCATGCTA TAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGTACGTACGAT Forward ou Primer Senso TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGTACGTACGAT 3
25 Como escolhê-los? ORIENTAÇÃO DOS INICIADORES: 5 -> ACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCATGCATGCTA 5 TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGTACGTACGAT 3
26 ORIENTAÇÃO DOS INICIADORES: 5 -> ACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCATGCATGCTA 5 TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGTACGTACGAT 3
27 Os iniciadores são sempre específicos? ORIENTAÇÃO DOS INICIADORES: 5 -> ACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCATGCATGCTA 5 CGGATATGCTAGCTAGAT 3 5 TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGTACGTACGAT 3
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29 Como escolhê-los? ORIENTAÇÃO DOS INICIADORES: 5 -> ACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCATGCATGCTA 3 CGGATATGCTAGCTAGAT 5 Reverse ou Primer Antissenso 5 TAGATCGATCGTATAGGC 3 5 TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGTACGTACGAT 3 COMPLEMENTAR REBATIDO ( Reverse Complement )
30 MAS POR QUE TODA ESSA TRABALHEIRA, MEU DEUS?
31 As sequências depositadas nos bancos de dados são referentes a uma única fita da dupla hélice!
32 Os iniciadores devem estar posicionados em sentidos opostos. Flanqueamento do segmento de interesse!
33 COMO DESENHAR INICIADORES?
34 Tamanho dos iniciadores (18 a 23 nt) Temperatura de melting (T m ): 60 C Temperatura de anelamento (T a ) Conteúdo CG
35 Tamanho dos iniciadores (18 a 23 nt) Temperatura de melting (T m ): 60 C Temperatura de anelamento (T a ) Conteúdo CG Formação de dímeros Forward Reverse 5 3 ATCGCTATCGGATCGATAGC CTATCGGCTTAGCATGCTAATC 3 5
36 Tamanho dos iniciadores (18 a 23 nt) Temperatura de melting (T m ): 60 C Temperatura de anelamento (T a ) Conteúdo CG Formação de dímeros 5 3 ATCGCTATCGGATCGATAGC... CTATCGGCTTAGCATGCTAATC 3 5
37 Tamanho dos iniciadores (18 a 23 nt) Temperatura de melting (T m ): 60 C Temperatura de anelamento (T a ) Conteúdo CG Formação de dímeros
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39 Será que toda PCR funciona?
40 ÀS VEZES DÁ PROBLEMA!
41 Como identificar erros de reação Quais os erros? M A1 A2 A3 A4 C -
42 Como identificar erros de reação Quais os erros?
43 Como identificar erros de reação M A1 A2 A3 A4 C -
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