ANÁLISE DA FREQUÊNCIA ALÉLICA DE 15 LOCI STR NA POPULAÇÃO DO RIO GRANDE DO NORTE

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ANÁLISE DA FREQUÊNCIA ALÉLICA DE 15 LOCI STR NA POPULAÇÃO DO RIO GRANDE DO NORTE TAISSA MARIA MOURA DE OLIVEIRA NATAL 2012

2 TAISSA MARIA MOURA DE OLIVEIRA ANÁLISE DA FREQUÊNCIA ALÉLICA DE 15 LOCI STR NA POPULAÇÃO DO RIO GRANDE DO NORTE Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito final à obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior NATAL 2012

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4 TAISSA MARIA MOURA DE OLIVEIRA ANÁLISE DA FREQUÊNCIA ALÉLICA DE 15 LOCI STR NA POPULAÇÃO DO RIO GRANDE DO NORTE Banca Examinadora: Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior Presidente UFRN Prof. Dr. Carlos Roberto Alves Examinador Externo FIOCRUZ/RJ Profa. Dra. Tereza Neuma de Souza Brito Examinador Interno UFRN Natal, 24 de fevereiro de 2012 NATAL / RN 2012

5 DEDICATÓRIA A meus pais, Jayme e Marizeth, pelo incentivo na busca do conhecimento. Fonte de inspiração, exemplo de dedicação e respeito. Aos meus irmãos Jayme Júnior e Sanderson, pelo apoio incondicional e amizade. À minha sobrinha Valentina, pela alegria que soma à minha vida. A eles, todo o meu amor e admiração.

6 AGRADECIMENTOS A Deus, fonte de toda Sabedoria. Por guiar meus passos e não me deixar fraquejar. A Ele, toda Honra e toda Glória. Aos meus pais, irmãos, sobrinha, cunhadas, meu muito obrigada por tudo. Ao Professor Dr. Geraldo Barroso pela sua orientação, amizade e confiança que tanto contribuíram para a minha formação acadêmica. Ao Laboratório DNA Center que me abriu as portas desde a graduação. Aos queridos mestres Gioconda Leão, Andréa Fernandes e Roberto Chaves por todos os ensinamentos e confiança depositada. Aos colegas e funcionários, em especial Juliana Freire pela ajuda neste trabalho. A Erica Gil, inicialmente uma parceira profissional, hoje, uma amiga que posso contar sempre. A todos os docentes do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, em especial o Professor Dr. Matheus Pedroza, por toda a dedicação nos momentos em que precisei de seus conselhos e orientações. Às funcionárias Fábia e Aureliana pela paciência, sempre dispostas a ajudar. À CAPES, pela concessão da bolsa de estudo. Ao Professor Dr. Paulo Marinho, quem primeiro me apresentou à Biologia Molecular, pelo constante apoio. Ao Professor e amigo Carlos Maia pela valiosa ajuda e disponibilidade. Aos amigos Paulo Raimann e Weslley Tsutsumida, da Life Technologies, por toda a ajuda despendida no início deste trabalho. À Italo Medeiros e ao Professor Dr. Flávio Freire pelo auxílio com as análises estatísticas.

7 Aos titulares da Banca Examinadora, Professora Dra. Tereza Neuma e Professor Dr. Carlos Roberto, pelas contribuições, críticas, elogios e por terem prontamente aceitado fazer parte desta banca. Aos meus verdadeiros amigos, irmãos que Deus me permitiu escolher, pelas críticas, sugestões, orações, paciência e incentivo. A todos, que de alguma forma, contribuíram para a minha formação pessoal e profissional, minha eterna gratidão!

8 RESUMO As populações humanas apresentam um considerável número de loci polimórficos, cujo uso e aplicações vão desde a construção de mapas de ligação até estudos de evolução das populações, passando pela determinação de paternidade, medicina forense e migração. Atualmente, os STRs (Short Tandem Repeats) são considerados os marcadores de identificação humana por excelência, título em grande parte devido a sua abundância e elevada variabilidade, devido ao fato de serem facilmente amplificáveis pela Reação em Cadeia da Polimerase, PCR (Polymerase Chain Reaction), funcionarem com baixas quantidades de DNA e serem passíveis de automação com processos envolvendo detecção por fluorescência. A formação de bancos de dados regionais, contendo as frequências alélicas da população de uma microrregião, fornece subsídios para aumentar a confiabilidade dos resultados de determinação de vínculo genético. Neste trabalho, visa-se a obtenção de um banco de dados das frequências alélicas de 15 loci polimórficos moleculares (D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D19S433, vwa, TPOX, D18S51, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D5S818 e FGA), em uma população classificada como nascida no Estado do Rio Grande do Norte, Brasil, totalizando 1100 indivíduos não aparentados. Para avaliação das frequências, amostras de DNA foram submetidas à amplificação por PCR, e os genótipos foram obtidos através de eletroforese capilar em sequenciador genético. As frequências apuradas no presente estudo foram comparadas com as da população brasileira em geral e com as de outros estados do Brasil. Com exceção dos loci D21S11, D19S433 e D2S1338, os genótipos encontrados da população do RN mostram-se em Equilíbrio de Hardy-Weinberg, e sem grandes diferenças significativas entre as frequências encontradas nas populações estudadas. Os loci mais informativos foram D2S1338 e D18S51, enquanto que o locus menos informativo foi o TPOX. Palavras-chave: Frequência alélica; STR; Rio Grande do Norte; Brasil.

9 ABSTRACT Human population have a significant number of polymorphic loci, whose use and applications range from construction of linkage maps, to study the evolution of populations, through the determination of paternity, forensic medicine and migration. Currently, STRs (Short Tanden Repeats) markers are considered the major markers for human identification, mainly due to its abundance and high variability because of the fact that they are easily amplifiable by PCR (Polymerase Chain Reaction), work with low amounts of DNA and be capable of automation processes involving fluorescence detection. The creation of regional databases containing allele frequencies of population provide subsidies to increase the reliability of the results of determining the genetic link. This paper aims to obtain a database of allele frequencies of 15 polymorphic molecular loci (D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D19S433, vwa, TPOX, D18S51, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D5S818 e FGA) in a population classifies as born in the State of Rio Grande do Norte, Brazil, totaling 1100 unrelated individuals. To evaluate the frequency, DNA samples were submitted to PCR amplification, followed by capilarry electrophoresis genetic sequencer. The frequencies identified in this study were compared with brazilian population in general and other states in Brazil. Except for the loci D21S11, D19S433 and D2D1338, the genotypes found were in Hardy-Weinberg equilibrium and no significant differences among the frequencies were found in the populations studied. The most informative loci was D2S1338 and D18S51, and the less informative is the locus TPOX. Keywords: Allele frequencies; STR; Rio Grande do Norte; Brazil.

10 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Estrutura do DNA composta por íntrons e exons 16 Figura 2 - Marcador STR 21 Figura 3 - Sequência do locus TPOX 21 Figura 4 - Funcionamento da eletroforese capilar 24 Figura 5 - Esquema do posicionamento do primers 24 Figura 6 - Material utilizado na extração de DNA 35 Figura 7 - Loci contemplados no kit AmpFlSTR Identifiler 37 Figura 8 - Eletroferograma 38 Figura 9 - Mesorregiões do Rio Grande do Norte 41 Figura 10 - Distribuição dos indivíduos estudados entre as mesorregiões 42 Figura 11 - Locus D21S11 54 Figura 12 - Locus D Figura 13 - Locus D3S Figura 14 - Locus VWA 55 Figura 15 - Locus D7S Figura 16 - Locus D16S Figura 17 - Locus D18S51 57 Figura 18 - Locus CSF 57 Figura 19 - Locus D5S Figura 20 - Locus TH01 58 Figura 21 - Locus TPOX 59 Figura 22 - Locus FGA 59 Figura 23 - Locus D8S Figura 24 - Locus D2S Figura 25 - Locus D19S433 61

11 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Distribuição das 1100 amostras entre as Mesorregiões 42 Tabela 2 - Frequência alélica e parâmetros estatísticos para os 15 STRs estudados na população do Rio Grande do Norte 43 Tabela 3 - Frequências alélicas para o locus D21S11 46 Tabela 4 - Frequências alélicas para o locus D13S Tabela 5 - Frequências alélicas para o locus D3S Tabela 6 - Frequências alélicas para o locus vwa 47 Tabela 7 - Frequências alélicas para o locus D7S Tabela 8 - Frequências alélicas para o locus D16S Tabela 9 - Frequências alélicas para o locus D18S51 48 Tabela 10 - Frequências alélicas para o locus CSF 48 Tabela 11 - Frequências alélicas para o locus D5S Tabela 12 - Frequências alélicas para o locus TH01 49 Tabela 13 - Frequências alélicas para o locus TPOX 49 Tabela 14 - Frequências alélicas para o locus FGA 49 Tabela 15 - Frequências alélicas para o locus D8S Tabela 16 - Frequências alélicas para o locus D2S Tabela 17 - Frequências alélicas para o locus D19S Tabela 18 - Alelos mais frequentes no RN e no Brasil 52 Tabela 19 - Alelos mais frequentes no RN e em Portugal 53

12 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AABB American Association of Blood Banks CODIS Combined Database Index System DNA Deoxyribonucleic acid FBI Federal Bureau Ivestigation FSS Forensic Science Service GEP Grupo Espanhol-Português IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística INDELs Polimorfismos de Inserção e Deleção ISFG Internatioanl Society of Forensic Genetic kb Kilobase MP Probabilidade de Matching NDNDA Banco de dados de DNA nacional do Reino Unido pb Par de base PCR Polymeraase Chain Reaction PD Poder de Discriminação PE Poder de Exclusão PIC Conteúdo de Informação Polimórfica PNCQ Programa Nacional de Controle de Qualidade RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SNP Single Nucleotide Polymorphism STR Short Tandem Repeat VNTR Variable Number of Tandem Repeats µl Microlitro

13 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 12 2 REVISÃO DE LITERATURA ESTRUTURA DO GENOMA HUMANO MARCADORES POLIMÓRFICOS DE USO CORRENTE EM GENÉTICA FORENSE STRs TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS À IDENTIFICAÇÃO HUMANA BANCOS DE DADOS ESTUDOS DE FREQUÊNCIA NA INVESTIGAÇÃO FORENSE 29 3 JUSTIFICATIVA 33 4 OBJETIVOS OBJETIVOS GERAIS OBJETIVOS ESPECÍFICOS 34 5 METODOLOGIA CASUÍSTICA MATERIAL E MÉTODOS Extração do DNA Amplificação Análise de Fragmentos Controles Análises Estatísticas Aspectos Éticos 40 6 RESULTADOS E DISCUSSÃO 41 7 CONCLUSÕES 62 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 63

14 12 1 INTRODUÇÃO A história da Genética Humana, como uma ciência baseada em teoria, começou em 1865 quando Gregor Mendel publicou o seu trabalho Experimentos em Plantas Híbridas. Posteriormente Galton, fundador da Eugenia, com seu estudo Talentos Hereditários e Caráter, procurou apresentá-la como a ciência que forneceria as bases teóricas para não só compreender os mecanismos da transmissão dos caracteres entre as gerações, como também contribuir positivamente para a melhoria das características do conjunto populacional. O campo da genética de populações surgiu entre as décadas de 1920 e 1930 graças a Ronald Fisher, John Burdon Sanderson Haldane e Sewall Wright, cujos trabalhos forneceram embasamento suficiente para a criação da Teoria Sintética da Evolução, ou Síntese Evolutiva Moderna. Esta pode ser compreendida, basicamente, por princípios que aliam a teoria da evolução das espécies de Charles Darwin às leis de herança biológica de Mendel e à própria genética populacional. Esta última fundamenta-se na descrição da variabilidade genética existente e na investigação dos mecanismos que a influenciam. Para isso, os trabalhos baseiam-se na observação da distribuição dos polimorfismos genéticos de indivíduos pertencentes a uma determinada população e suas variações sob a influência de forças evolutivas como seleção natural, deriva genética, mutação e fluxo gênico (BEIGUELMAN, 2008). Há mais de um século, desde a descoberta dos grupos sanguíneos, que polimorfismos em humanos vêm auxiliando a resolução de questões forenses. Iniciando pelo polimorfismo de grupos sanguíneos, em seguida pelos polimorfismos de grupos protéicos/enzimáticos e pelos primeiros polimorfismos em sequência de DNA (RFLPs), o grande salto deu-se com a identificação dos polimorfismos de sequência repetitivas do tipo minissatélites (SCHNEIDER, 1997). Os minissatélites e sua alta variabilidade permitiram ao Sir Alec Jefreys, no início da dedada de 80, as primeiras aplicações da genética forense em um contexto moderno como conhecemos hoje. No entanto, foi a caracterização dos microssatélites e a possibilidade de genotipá-los por PCR os eventos que permitiram ao campo da genética forense sua consolidação. Atualmente, a base de qualquer laboratório de genética forense é a utilização de, no mínimo, 13 microssatélites autossômicos

15 13 amplificados pela PCR e genotipados utilizando a eletroforese em sequenciadores automáticos de DNA (BUTLER, 2005). Quimicamente, o DNA é igual em todas as pessoas, diferindo somente no conteúdo informacional que é dado pela sequência de bases. Cerca de apenas 0,1% de todo o genoma humano difere de uma pessoa para outra, sendo justamente nesta diferença em que se baseiam as técnicas de identificação, pois não existem duas pessoas com a mesma sequência de bases no seu DNA, exceto no caso de gêmeos idênticos (NAKAMURA, Y. 2009). Com o início do Projeto Genoma Humano em 1990 e subsequente disponibilização de sequenciadores automáticos de DNA capazes de gerar dados genômicos em grande escala, surgiu a necessidade de novas ferramentas estatísticas para a análise desses bancos de dados (BUTLER, 2006). Importante ressaltar que o advento das técnicas de análise do DNA propiciou a fixação estatística da paternidade, atribuindo o percentual de certeza de que aquela alegada paternidade seria efetivamente correspondente ao vínculo biológico requerido. Isso é feito por meio de cálculos de probabilidade que inferem 100% à exclusão de vínculo investigado e taxa muito próxima desse percentual para inclusão (PENA, 2005). Há um número variado de materiais biológicos para obtenção do DNA e realização de testes laboratoriais de identificação humana, tais como tecido ósseo, bulbo capilar, material de biópsia, saliva, sangue, dentre outros. É possível obter DNA de praticamente todos os tecidos do corpo humano, variando apenas a quantidade de DNA que é possível extrair de cada um desses tecidos (STRACHAN; READ, 2002). O Brasil, com sua população de proporções continentais, altamente polimórfica em virtude de sua miscigenação, necessita de estudos que auxiliem no melhor entendimento desta. Diante disso, o presente estudo tem como objetivo realizar uma análise da frequência alélica de 15 loci STR, em população nascida no Estado do Rio Grande do Norte, a fim de viabilizar sua aplicação em casos de investigação de paternidade e forenses, através da utilização de parâmetros estatísticos, além de um melhor entendimento da formação da população do nosso Estado.

16 14 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 ESTRUTURA DO GENOMA HUMANO Em 1953, os cientistas Francis Crick e James Watson descobriram a estrutura do DNA, que é uma macromolécula formada pelo encadeamento de subunidades individuais denominadas de nucleotídeos. Por sua vez, cada nucleotídeo é composto de três unidades básicas: um grupamento fosfato, um açúcar (pentose) e uma base nitrogenada, podendo esta ser Adenina, Timina, Citosina ou Guanina. (BUTLER, 2005). O DNA é responsável pelo armazenamento de toda a informação genética, sendo encontrado nos cromossomos do núcleo (DNA genômico) e nas mitocôndrias (DNA mitocondrial), podendo ser extraído de amostras de sangue, esfregaço bucal, saliva, ossos, dentes, tecidos, órgãos, fios de cabelo, sêmen, urina, dentre outros materiais biológicos (STRACHAN; READ, 2002). É nele que estão localizados os genes, depositários das informações genéticas responsáveis pelas atividades da célula. Cada gene, por sua vez, faz parte de uma estrutura denominada cromossomo e encontra-se em locais específicos conhecidos como locus genético (ALBERTS et al., 1999). A sequência de nucleotídeos codifica a sequência de aminoácidos através dos códons, entretanto, somente cerca de 3 a 5% do conteúdo total de DNA codifica proteínas. Essas sequências codificadoras são intercaladas por extensas sequências de DNA inativo (não-codificador). As regiões do DNA que codificam proteínas são chamadas de éxons, enquanto as regiões que não codificam proteínas, pois são removidas após a transcrição do DNA, são chamadas de íntrons. Estes apresentam tamanho variável que pode ser de 50 até nucleotídeos, considerando-se que, em muitos casos, o tamanho cumulativo dos íntrons é muito maior que o dos éxons (MARQUES et al, 2003; ALBERTS et al, 1999). Os íntrons contêm uma grande proporção de DNA repetitivo (grupos de pares de bases que se repetem, lado a lado). O DNA de cópia única constitui aproximadamente 50% do genoma humano, enquanto que o genoma restante é composto por sequências de

17 15 DNA repetitivo que se intercalam com DNA de cópia única. A função da maior parte desse DNA repetitivo ainda não é conhecida, porém, aparentemente uma pequena parte dele atua na estabilização da estrutura do cromossomo (NAKAMURA, 2009; ALBERTS et al, 1999). O DNA repetitivo não codificador pode ser classificado em DNA repetitivo disperso ou DNA satélite. O DNA repetitivo disperso é composto por sequências não agrupadas, mais complexas, espalhadas em numerosas localizações no genoma. Já o DNA satélite possui sequências agrupadas que constituem de 10 a 15% do genoma (JORDE, 2004) A sequência como estão dispostas as bases nitrogenadas no DNA é o que diferencia o genoma de cada pessoa, pois a estrutura química é igual para todos. No genoma humano existem mais de três bilhões de nucleotídeos. Deste total, cerca de 99,9% das regiões do DNA possuem a mesma sequência de bases nitrogenadas. Apenas 0,1% das regiões da molécula apresentam variações na sequência de nucleotídeos, são os chamados polimorfismos do DNA. As técnicas de identificação humana se apóiam na análise dessas regiões variáveis. O estudo da variabilidade destas regiões tem levado à conclusão de que não existem duas pessoas que apresentem a mesma sequência de DNA, com exceção dos gêmeos univitelinos (NAKAMURA, Y. 2009; LI et al, 2009). As diferentes variações no número de repetições do DNA em um determinado local do cromossomo são chamadas de alelos, que constituem o que é conhecido como polimorfismo genético. Nos indivíduos, em cada locus há dois alelos, com exceção dos cromossomos sexuais no sexo masculino, que apresentam um alelo em cada locus tanto no cromossomo X quanto no cromossomo Y. Quando dois alelos são idênticos, o indivíduo é homozigoto e quando são diferentes, ele é heterozigoto para esse locus (OTTO, 2004).

18 16 Figura 1: Estrutura do DNA composta por íntrons e éxons. Os íntrons são removidos após a transcrição e os éxons são unidos e então as proteínas são codificadas Fonte: Já o DNA mitocondrial é outro tipo de material que pode ser utilizado na identificação humana, sendo a principal vantagem o seu alto número de cópias por célula (de centenas a milhares de organelas). Em casos onde a amostra de DNA extraída é muito pequena ou degradada, tal como em tecidos esqueletizados, a probabilidade de obtenção de um perfil de DNA a partir do DNA mitocondrial é maior que qualquer marcador encontrado no DNA genômico (PANETO, 2006; SWEET; DIZZINO, 1996). Por este motivo, a análise do DNA mitocondrial para fins forenses fica reservada principalmente para tecidos antigos como ossos, cabelos e dentes, nos quais o DNA nuclear já não oferece mais condições de análise (BUDOWLE et al., 2003). 2.2 MARCADORES POLIMÓRFICOS DE USO CORRENTE EM GENÉTICA FORENSE Nos testes de determinação de identidade genética são estudadas regiões genômicas em que há variação entre pessoas normais, sendo tais regiões chamadas de polimorfismos de DNA ou marcadores de DNA. Nos últimos anos foram desenvolvidas diversas técnicas para estudo de diferentes tipos de

19 17 polimorfismos de DNA, no qual os cientistas e laboratórios podem escolher o método mais adequado para solucionar problema em mãos (PENA, 2005). O DNA satélite é composto por sequências altamente repetitivas simples ou moderadamente complexas. As sequências deste tipo de DNA ocorrem em tandem, ou seja, de maneira consecutiva, e sua classificação é realizada segundo a localização no genoma, número total de repetições e comprimento das unidades repetidas. O DNA satélite pode ser agrupado em duas subclasses principais (BUTLER, 2006): Minissatélites ou VNTR (Variable Number of Tandem Repeats ou Número Variável de Repetições Consecutivas): Sequências de tamanho médio (de 10 a 100 pb) cujo número de repetições pode variar desde duas até vinte ou mais repetições; Microssatélites ou STRs (Short Tandem Repeats ou Repetições Curtas Consecutivas): Pequenas repetições, em geral de 2 a 4 nucleotídeos. Geralmente são observados até 30 alelos em uma população para apenas 1 locus. Mais recentemente, os abundantes polimorfismos de base única (SNPs) e os polimorfismos de inserção/deleção (INDELs) têm emergido como possíveis alternativas às ferramentas moleculares em genética forense. MINISSATÉLITES OU VNTRs (DNA FINGERPRINT) Em 1985, Jeffreys e colaboradores, na Inglaterra, foram os primeiros a demonstrar que algumas sondas especiais (sondas multilocais) eram capazes de reconhecer simultaneamente diversas regiões de minissatélites, produzindo padrões de bandas complexos e específicos para cada indivíduo. Estes padrões foram chamados de "Impressões Digitais de DNA" ou DNA Fingerprint, uma vez que tal resultado proporcionava um padrão único de identificação de cada indivíduo, tornando bastante improvável que duas pessoas possuam o mesmo perfil, salvo em casos de gêmeos univitelinos (Pena, 2005). A técnica utilizada para o estudo destas sequências altamente polimórficas, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), se baseia no fato de que a molécula de DNA pode ser cortada em sítios específicos por proteínas denominadas enzimas de restrição. O RFLP é gerado por diferenças no tamanho do fragmento de

20 18 DNA digerido pela enzima de restrição devido a substituições no sítio de reconhecimento da endonuclease (BUTLER, 2005). Os minissatélites possuem locus mais polimórficos que os microssatélites. Geralmente, enquanto 5 loci de VNTR são suficientes para obtenção de resultados satisfatórios na identificação humana, cerca de 12 ou mais loci de STR são necessários para o mesmo resultado. Entretanto, os VNTRs estão, atualmente, em desuso na resolução de casos médico-legais, devido ao fato de, entre outras razões, requerem uma quantidade apreciável de DNA não degradado, além de se tratar de uma metodologia bastante laboriosa e demorada (NAKAMURA, 2009). MICROSSATÉLITES OU STRs São constituídos de pequenas sequências repetidas consecutivamente que ocorrem a cada 20 kb no genoma humano. Essas sequências repetitivas podem ter de 2 a 5 pb e geralmente não ultrapassam os 200pb. Nos últimos anos, a descoberta e o desenvolvimento dos STRs polimórficos como marcadores genéticos estimularam a elaboração de mapas de ligação, a identificação e caracterização de genes ligados a doenças e a simplificação e precisão da tipagem de DNA com intuito de identificar pessoas (BUTLER, 2005). Na tipagem de regiões STR, através da técnica PCR, são utilizados, usualmente, sistemas multiplexes, onde vários pares de primers orientam simultâneas reações de amplificação, gerando produtos de múltiplos loci. Os alelos amplificados são separados em eletroforese. Estes são denominados em função do número de vezes que uma determinada unidade de repetição está presente no lócus em questão. Esta forma de nomenclatura permite uma melhoria na padronização (BUTLER et al., 2004). Com o avanço da tecnologia, foram desenvolvidos processos automatizados para análise de loci STR. Acoplou-se a produção de primers marcados com diferentes corantes fluoróforos e sistemas de detecção a laser em aparatos de separação eletroforética. Sistemas para amplificação simultânea de 15, 21, até 31 loci STR (ROBLEDO et al, 2009) já encontram-se disponibilizados para uso corrente em tipagem humana por DNA. Desta maneira, a tipagem ou identificação de um indivíduo, pode ser realizada em um único tubo, no qual múltiplas reações de amplificação estarão sendo processadas (BUTLER, 2005).

21 19 A amplificação de loci STRs por sistema Multiplex oferece diversos benefícios para a análise de amostras biológicas. Primeiramente, torna-se capaz de analisar uma grande quantidade de marcadores genéticos consumindo apenas uma pequena alíquota de amostra. Assim, menos amostra é consumida em comparação ao que poderia ser utilizado se fossem analisados os loci separadamente. Consequentemente, ao se amplificar todos os loci desejados em uma única reação, diminui-se a manipulação, reduzindo a possibilidade de contaminação. Por último, o sistema multiplex facilita a automatização de processos analíticos (BUDOWLE, 2011). MARCADORES BI-ALÉLICOS Além dos minissatélites e microssatélites há dois grandes grupos de polimorfismos no genoma humano - os polimorfismos de substituição de nucleotídeos únicos (Single Nucleotide Polymorphisms, ou SNPs) e os polimorfismos de inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos (INDELs). (KOCH, 2008), sendo os SNPs mais abundantes, com mais de 10 milhões já identificados e mapeados no genoma humano. Podem ser estudados em produtos de amplificação muito curtos, de aproximadamente 50 pb ou menos, o que é vantajoso quando se tem DNA extremamente degradado, ou em pouca quantidade (PENA, 2005). Entretanto, os SNPs apresentam algumas limitações. Primeiro, o número de SNPs necessários é quatro vezes maior do que o número de STRs (CHAKRABORTY et al., 1999; GILL, 2000). Assim, aproximadamente 60 SNPs serão necessários para se obter um poder de discriminação equivalente àquele obtido com os sistemas multiplex de STRs em uso na área forense (GILL et al, 2004). Além disso, as vantagens de custo ainda não estão claras. A despeito das vantagens e desvantagens da aplicação de SNPs em genética forense, os teste de paternidade ainda podem ser realizados de maneira mais simples e a custo mais baixo utilizando os STRs, sem falar na experiência em STRs ao longo dos últimos 10 anos (AMORIM; PEREIRA, 2005).

22 STRs Os marcadores STRs foram primeiramente descritos como ferramenta efetiva para identificação humana no início de 1990 (BUTLER, 2006). Os de maior valor para a identificação humana são aqueles que apresentam maior polimorfismo (maior número de alelos), menor tamanho, maior frequência de heterozigotos (maior que 90%) e baixa frequência de mutações (GALANTE FILHO et al, 1999). Devido ao seu alto poder de discriminação entre indivíduos e praticidade, a análise de STRs se tornou rotina em testes de parentesco e genética forense. A sensibilidade, maior polimorfismo, elevado índice de discriminação e heterozigose são características importantes na escolha de determinados STRs para fins forenses (TAMAKI; JEFFREYS, 2005). Além da classificação de acordo com o tamanho, os STRs também podem ser classificados de acordo com a composição dos blocos de sequência. Aqueles com repetições de mesmo tamanho e sequência são classificados como microssatélites de repetição simples. Microssatélites com duas ou mais repetições simples adjacentes diferindo nos motivos de repetição são classificados como repetições compostas. Microssatélites complexos são aqueles constituídos por blocos de repetição variando em tamanho. Microssatélites com blocos diferindo em tamanho e em sequência são classificados como repetições complexas hipervariáveis. Essa última categoria de marcadores do tipo STR não é comumente utilizada em tipagem de DNA forense devido a dificuldades com nomenclatura alélica e medida de variabilidade entre laboratórios. (BUTLER, 2005). De acordo com as recomendações internacionais, designadamente da Sociedade Internacional de Genética Forense (ISFG), a denominação dos alelos dos STRs deve fazer-se de acordo com o número de unidades de repetição, exemplificadas nas figuras 2 e 3. A figura 2 mostra o alelo 7 do locus D5S818, ou seja, 7 repetições da sequência AGAT neste locus, já a figura 3 mostra a representação do alelo 11 do locus TPOX.

23 21 Figura 2: Marcador STR, mostrando sete unidades de repetição AGAT do locus D5S818 Figura 3: Sequência do locus TPOX no Genbank, mostrando as unidades de repetição deste. Fonte: Existem situaçõess onde um alelo de um loco STR contém um número incompleto de repetições. Microvariantes é o termo dado aos alelos que contém unidades de repetição incompleta. Se um alelo apresentar uma unidade de repetição incompleta, será designado pelo número de unidades de repetição completas e pelo número de pares de bases da unidade de repetição incompleta, separados por um ponto (DIXON et al., 2006). Um exemplo comum de uma microvariante é o alelo 9.3 no loco TH01, que contém nove repetições tetranucleotídicas e uma repetição

24 22 incompleta de três nucleotídeos, pois na décima repetição falta uma única adenina fora da normal na unidade de repetição AATG (BUTLER, 2006). As análises de STRs são de fundamental importância para a ciência forense, principalmente coma criação de bancos de dados contendo as frequências alélicas de STRs das populações. Os cálculos estatísticos utilizam como base as frequências alélicas de cada marcador STR encontrado em representantes da população estudada (GILL, 2006). 2.3 TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS À IDENTIFICAÇÃO HUMANA Os testes de vínculo genético por DNA são de alta confiabilidade, sendo aceitos como prova legal em casos judiciais, como inclusão e exclusão de paternidade e na identificação humana (PARDINI et al, 2001), sendo possível obter DNA de praticamente todos os tecidos do corpo humano, variando apenas a quantidade de DNA que é possível extrair de cada um desses tecidos (BUTLER, 2005) A investigação de vínculo genético sempre mereceu atenção especial da sociedade e da justiça. No início, os casos de paternidade eram resolvidos utilizando-se os polimorfismos eritrocitários e protéicos. Estas técnicas, apesar de simples e baratas, tinham a desvantagem de só fazer afirmações sobre a exclusão da paternidade e apenas a suposição sobre a probabilidade de um determinado indivíduo ser o pai biológico da pessoa em questão. Outra desvantagem com relação à análise de proteínas se relaciona à quantidade de material biológico necessária para a realização dos testes e a facilidade com que se degradam, além de não serem capazes de detectar muitos alelos. Para estudos de identificação humana elas não são as mais indicadas devido ao seu baixo poder discriminatório (KOCK; ANDRADE, 2008). Em 1985, Jeffreys et al. propuseram a existência de polimorfismos no DNA humano. Ao contrário da análise convencional de grupos sanguíneos, a qual depende de sangue ou outros fluidos corpóreos, os resultados dos perfis analisados

25 23 não dependem da natureza do material ou do tipo celular analisado, uma vez que a informação genética está contida em todas as células somáticas de todos os indivíduos. Por este motivo, o mesmo tipo de DNA de um determinado indivíduo pode ser obtido de qualquer tecido do corpo humano, enquanto que a análise utilizando marcadores protéicos ou sanguíneos é restrita a células onde tais proteínas ou antígenos são expressos e secretados (SCHNEIDER, 1997). Outro passo importante foi dado quando se verificou que era possível utilizar a técnica de PCR na detecção de polimorfismos no DNA. A PCR consiste na reprodução, in vitro, do processo de duplicação do DNA. Uma ou mais fitas de DNA servem como molde (template), e têm uma dada sequência gênica demarcada através de oligonucleotídeos primers (cerca de 20 pares de bases). Estes se anelam, por hibridação, às suas sequências complementares, indicando o início e o fim do fragmento desejado, que passa a ser copiado, através do acréscimo, em ambas as fitas do DNA molde, de nucleotídeos complementares presentes na reação, sob a ação de uma enzima Taq DNA Polimerase, termorresistente, proveniente da bactéria Thermus aquaticus (BUTLER, 2005). Com a automação, uma das técnicas de grande destaque para avaliação dos produtos amplificados é a eletroforese capilar. Nesta técnica, cada amostra, já amplificada pela PCR, é processada em cerca de 40 minutos e os produtos da PCR são separados por tamanho e cor do fluorocromo, utilizando eletroforese seguida por detecção baseada na fluorescência induzida por laser. Uma voltagem é aplicada por um determinado tempo para mover as moléculas da amostra através do polímero presente no capilar. Quando os fragmentos de DNA alcançam a janela de detecção, as moléculas marcadas com corantes são excitadas pelo laser, emitindo fluorescência. Esta é coletada simultaneamente e espectralmente separadas. Um padrão interno, contendo fragmentos de DNA de tamanho conhecido e marcado com corante diferente, deve ser processado por eletroforese junto com cada amostra. Os dados, coletados na forma de eletroferogramas, são analisados por um software que automaticamente determina o tamanho dos alelos com base no padrão interno (BUTLER, 2004). O funcionamento da eletroforese capilar é esquematizado na figura 4.

26 24 Figura 4: Funcionamento da eletroforese capilar (BUTLER, 2005) A figura 5 mostra um marcador STR em um DNA molde e os primers que se anelam em ambos os lados da região de repetição. Um dos primers é marcado na extremidade 5 terminal com um fluorocromo, e estes primers definem o tamanho global do produto de PCR, assim como o número de repetições presentes na região STR. Os produtos de PCR são separados por tamanho e cor do fluorocromo durante a eletroforese (BUTLER, 2004). Figura 5: (A) Esquema do posicionamento dos primers para amplificação de um marcador STR. (B) Padrão de peso molecular para o marcador D3S1538 e duas amostras de DNA, heterozigotas, mostrando diferentes genótipos. Valores abaixo dos picos indicam o número de sequências repetidas presentes no alelo (BUTLER, 2004).

27 25 Foi observado então que, além de completamente compatíveis com os resultados obtidos com os métodos anteriormente utilizados (grupos sanguíneos, Antígenos Leucocitários Humanos ou HLA), o DNA é mais informativo, pois seu elevado polimorfismo permite a inclusão de paternidade (NAKAMURA, 2009). Os métodos disponíveis até então só permitiam fazer exclusões a respeito da paternidade. Importante ressaltar que o advento das técnicas de análise do DNA propiciou a fixação estatística da paternidade, atribuindo o percentual de certeza de que o indivíduo é o pai biológico (inclusão de paternidade). Isso é feito por meio de cálculos de probabilidade, que inferem 100% à exclusão do vínculo investigado e taxa próxima desse percentual para a inclusão de paternidade (PENA, 2005). Assim, a análise estatística envolvida nos procedimentos de DNA passou a ser de primordial importância, não só em processos de investigação de paternidade, como também em questões forenses. De acordo com a AABB (American Association of Blood Bank), órgão regulamentador para testes de vínculo genético para identificar indivíduos, recomenda-se o estudo de, no mínimo, 13 loci, e os dados são usados para criar um perfil de DNA de cada indivíduo (BUTLER, 2005). Em caso de identificação forense, alguns exemplos do uso do DNA podem ser listados, tais como: Identificar potenciais suspeitos, dos quais o DNA foi encontrado em cenas de crime; Inocentar pessoas acusadas erroneamente de crimes; Identificar vítimas de crimes e catástrofes; Estabelecer paternidade ou outro vínculo familiar. O Federal Bureau of Investigation (FBI) usa um padrão de 13 STR loci específicos para o CODIS (Combined DNA Index System), o programa de computador que opera os bancos de dados locais, estaduais e nacionais de perfis de DNA de criminosos, pessoas envolvidas em crimes não resolvidos e pessoas desaparecidas. A possibilidade de dois indivíduos possuírem o mesmo perfil nos 13 loci analisados é de um em um bilhão (BUTLER, 2005).

28 26 No nosso estudo, foram analisados 15 loci, abaixo listados no Quadro 1: LOCUS LOCALIZAÇÃO TPOX CROMOSSOMO 2 2p25.3 D2S1338 CROMOSSOMO 2 2q35 D3S1358 CROMOSSOMO 3 3p21 FGA CROMOSSOMO 4 4q28 D5S818 CROMOSSOMO 5 5q21-q31 CSF1PO CROMOSSOMO 5 5q D7S820 CROMOSSOMO 7 7q21.11 D8S1179 CROMOSSOMO 8 8q TH01 CROMOSSOMO 11 11p15.5 VWA CROMOSSOMO 12 12p13.31 D13S317 CROMOSSOMO 13 13q22-q31 D16S539 CROMOSSOMO 16 16q22-24 D18S51 CROMOSSOMO 18 18q21.3 D19S433 CROMOSSOMO 19 19q12 D21S511 CROMOSSOMO 21 21q21.1 SEQUÊNCIA REPETITIVA GAAT [TGCC][TTCC] [TCTG][TCTA] CTTT AGAT TAGA GATA [TCTA][TCTG] TCAT [TCTG][TCTA] TATC GATA AGAA AAGG [TCTA][TCTG] MARCADOR FLUORESCENTE NED (Amarelo) VIC (Verde) VIC (Verde) PET (Vermelho) PET (Vermelho) 6-FAM (Azul) 6-FAM (Azul) 6-FAM (Azul) VIC (Verde) NED (Amarelo) VIC (Verde) VIC (Verde) NED (Amarelo) NED (Amarelo) 6-FAM (Azul) ACESSO GENBANK M68651 G08202 NT_ M64982 G08446 X14720 G08616 G08710 D00269 M25858 G09017 G07925 L18333 G08036 AP Quadro 1: Localização no genoma dos loci analisados, sua sequência, fluoróforo marcador e acesso no Genbank (Fonte: BUTLER, 2005; Applied Biosystems)

29 BANCOS DE DADOS O crescimento de bancos de dados de DNA vem fazendo aumentar o envolvimento da polícia científica no auxílio da aplicação da lei. Além de sua função essencial de ligar crimes e suspeitos, tais bancos colecionam informações sobre crimes e criminosos. A análise desses dados pode aumentar a compreensão do contexto no qual as Ciências Forenses funcionam como ferramentas para a justiça criminal (SMITH, 2006; SCHNEIDER, 2009). A aprovação da primeira legislação que permitia a coleta e o armazenamento de amostras de DNA de condenados deu-se na Virgínia (EUA) em 1989, e os bancos de dados de DNA eram compostos por perfis VNTR. Porém foi o Reino Unido que estabeleceu legalmente um banco de dados de DNA nacional baseado em uma pelataforma de tecnologia STR (BUTLER, 2006). O Forensic Science Service (FSS), órgão inglês pioneiro no desenvolvimento e implementação de tecnologias de DNA e em abrir caminho para a formação do primeiro banco de dados no mundo, começou a procurar novos loci e variação na população de estudo com candidatos de loci STR. Juntamente com outros laboratórios europeus, lançaram o sistema multiplex SGM, e em 1995 foi lançado o NDNAD (Banco de Dados de DNA Nacional do Reino Unido) que contemplava o sistema multiplex SGM adicionado ao marcador sexual Amelogenina (WERRET, 1997; BUTLER, 2006). Observando o sucesso obtido pela tipagem por STR no Reino Unido, o laboratório do FBI (Fereral Bureau of Investigation) liderou esforços nos EUA para estabelecer o núcleo dos loci STR que formariam o CODIS (Combined DNA Index System), sistema nacional de banco de dados americano, o mais conhecido e mais importante no mundo. Em um projeto que durou aproximadamente 18 meses e envolveu 22 laboratórios americanos, foram avaliados 17 loci STR de kits já comercializados e em testes, das empresas Applied Biosystems e Promega Corporation, e em 1997 foram anunciados os 13 loci STR que compunham o CODIS, quais sejam: CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51 e D21S11 (BUTLER, 2004, 2006). Nesse sistema existem dois arquivos diferentes de perfis genéticos cujos objetivos se completam: o Forensic Index (Índice Forense) que contém perfis genéticos

30 28 obtidos a partir de cenas de crime; e o Offender Index (Índice de Criminosos) que contém perfis genéticos de criminosos condenados por crimes sexuais e outros crimes violentos (PENA, 2005). A possibilidade de dois indivíduos possuírem o mesmo perfil nos 13 loci analisados é de um em um bilhão. Os mesmos marcadores STRs são usados em várias circunstâncias. Existem oito loci STR (FGA, TH01, VWA, D3S1358, D8S1179, D16S539, D18S51 e D21S11) que compões tanto o banco de dados dos Estados Unidos quanto o da Europa, fato este que permite uma possível colaboração internacional (BUTLER, 2005). Atualmente muitos países dispõem de sistemas de Bancos de Dados de DNA, como a Nova Zelândia, Alemanha, Áustria, Suíça, Canadá, França, Itália e, na América do Sul, o Chile. Existem programas para implantação de bancos de dados de DNA em países como Argentina, Cuba, Líbano, entre outros (GILL, 2006). O Brasil ainda não conta com um sistema de banco de dados de informações genéticas de criminosos ou pessoas desaparecidas como ferramentas investigativas eficientes para armazenamento, busca e cruzamento de informações (FIGUEIREDO; PARADELA, 2010), embora já existam esforços para uma padronização em relação aos métodos para análise de DNA. Em 2005 foi criada no Brasil a Rede Nacional de Genética Forense, formado por peritos federais e estaduais, atuantes em Genética Forense, e professores universitários. Em 2009, o CODIS, sistema nacional de banco de dados americano, foi repassado para o Brasil pelos EUA sem ônus algum. Todos os 17 estados brasileiros que possuem laboratório de DNA criminal assinaram os Acordos de Cooperação Técnica com a Polícia Federal, sendo o sistema já instalado em No Nordeste, apenas os estados de Ceará, Paraíba e Bahia contribuem com o Banco Nacional de DNA (JACQUES, 2011). O banco de dados de perfis genéticos é usado para comparar perfis de suspeitos cadastrados no banco e identificar criminosos a partir de outros crimes, podendo ser usado para provar a inocência ou culpa de suspeitos, assim como identificar restos mortais e amostras biológicas (DOLINSKY; PEREIRA, 2007). Esse banco tem alterado o sistema de justiça criminal em muitos países, principalmente por fornecer a chance de identificação de indivíduos e resolução de casos sem suspeitos, caso não existam amostras para serem comparadas com o material coletado na cena do crime (WALSH, 2004).

31 29 Ao longo da aplicação dos conhecimentos do DNA para a viabilização da Justiça, foram sendo desenvolvidos bancos de dados das padronizações genotípicas das populações. Inicialmente, utilizavam-se nas identificações das frequências populacionais os bancos de dados do FBI para a população geral norte-americana. Posteriormente a caucasóide norte-americana. Depois a população geral latinoamericana, a caucasóide, negróide e amarela latino-americana e, finalmente, passouse a utilizar os bancos de dados específicos da população brasileira (GRATTAPAGLIA et al. 2001) 2.5 ESTUDOS DE FREQUÊNCIA NA INVESTIGAÇÃO FORENSE O delineamento das experiências de Mendel permitiu-lhe uma interpretação estatística muito simples dos resultados, mas suficiente para enunciar alguns princípios básicos da hereditariedade. Com base num grande número de cruzamentos de ervilhas, Mendel "probabilizou" os diferentes genótipos, fenótipos e a presença de genes que estão associados à transmissão da hereditariedade de geração em geração (BEIGUELMAN, 2008). Li et al. (2009) mostraram que a variação genética dentro da população é responsável pela maioria da diversidade humana; no entanto, a variação entre as populações é suficiente para mostrar a presença de estrutura genética entre estas. A contribuição genética ancestral pode ser obtida por meio da comparação da frequência de alelos de determinadas regiões genômicas entre a população alvo e as possíveis parentais, ou seja, aquelas que contribuíram de alguma forma com alguns indivíduos, genomas, para a formação da população alvo (RIBEIRO, 2009). A Genética Populacional tem como um dos objetivos analisar as consequências da aplicação dos princípios mendelianos em determinada população, estudando os efeitos das mutações, seleção natural, migração e deriva genética. É de grande interesse em Antropologia e em Medicina legal, pois quando se efetua a valorização da prova pericial, se faz necessário conhecer alguns parâmetros estatísticos da população referência (BEIGUELMAN, 2008). Sabe-se que diferentes populações apresentam alelos em frequências diferentes e algumas vezes únicos, por isso a necessidade do estudo de diferentes

32 30 marcadores naquela população para saber quais alelos presentes e em que frequência, a fim de se definir quais são os melhores marcadores a serem utilizados nestes casos. Assim, para que a identificação através de STRs possa ser rapidamente incorporada com efetiva confiabilidade à população brasileira, é de extrema importância a realização de estudos populacionais (OLIVEIRA et al, 2002) e nestes estudos a investigação deve ser realizada em indivíduos sem nenhum grau de parentesco, a fim de possibilitar a determinação da frequência alélica da população. Para a realização da identificação humana é mais interessante utilizar marcadores moleculares que apresentem grande variabilidade dentro da população, ou seja, alto grau de polimorfismo, de forma que a probabilidade de duas pessoas apresentarem um mesmo alelo torne-se menor. Sendo assim, a realização de pesquisas para a obtenção de frequências alélicas populacionais tornam-se extremamente importantes, possibilitando a divulgação desses dados, através da literatura científica e, também, por banco de dados (sistemas nos quais são armazenados perfis de DNA referentes a um conjunto de marcadores moleculares) podendo ser aplicados na investigação forense (GÓIS, 2006). Populações que se encontram em regiões diferentes ou apresentam origem distinta podem apresentar alelos em frequências diferentes e algumas vezes, únicos. Portanto, quando se deseja identificar um indivíduo proveniente de determinada população, é necessário o estudo de diferentes marcadores naquela população para saber quais são os alelos presentes e em que frequência, a fim de se definir quais são os melhores marcadores a serem utilizados nestes casos. Tal distribuição alélica será aplicada nos cálculos estatísticos realizados em testes de identificação humana e de paternidade, a fim de dar força e credibilidade às informações obtidas pela análise da evidência genética (amostra biológica). A base para esses cálculos de frequências de alelos derivou dos estudos de Hardy- Weinberg. O Princípio de Hardy-Weinberg é um modelo matemático simples que demonstra que as frequências genotípicas de uma população se mantêm constantes quando não há força evolutiva atuando sobre a mesma. Para que o princípio possa ser demonstrado, a população em questão deve estar em equilíbrio genético, devendo ela apresentar as seguintes características (BEIGUELMAN, 2008): 1) A população analisada deve ser grande o suficiente para que não ocorram desvios estatísticos;

33 31 2) Não deve haver fluxo gênico entre diferentes populações; 3) Não deve haver a ocorrência de mutações; 4) Os casamentos devem ocorrer aleatoriamente, não existindo, por conseguinte, casamentos preferenciais entre indivíduos por causa de seu genótipo, fenótipo, estratificação social ou consangüinidade. Aliás, por serem os casamentos realizados aleatoriamente, os casamentos consangüíneos podem existir, desde que ocorram aleatoriamente 5) Não pode haver atuação da seleção natural. Este tipo de população é chamada de população ideal e apesar de nenhuma população humana preencher as condições descritas acima, a prática tem demonstrado que em numerosas populações humanas, os genótipos se distribuem de acordo com a Lei de Hardy-Weinberg, sendo esta muito útil para se estudarem populações e os mecanismos evolutivos que violam o Princípio (BEIGUELMAN, 2008). Existem diversos parâmetros estatísticos para determinar a eficácia de um marcador genético na conclusão de casos na área da Genética e Biologia Forense, sendo diferentes para cada situação (investigação biológica de filiação, criminalística biológica e identificação genética individual). Para que se possa usar um marcador genético tem que se realizar um estudo desse marcador na população em questão. Abaixo estão listados aguns dos principais parâmetros populacionais usado em Genética e Biologia Forense (BEIGUELMAN, 2008; McMANUS et al, 2011): Poder de Exclusão: O PE de um marcador genético numa determinada população é um parâmetro importante no que concerne à investigação biológica da paternidade. Pode ser definido como a percentagem de indivíduos falsamente acusados, cuja paternidade ficaria excluída, com base nesse marcador. Poder de Discriminação: O PD é um parâmetro estatístico a priori que se define como a probabilidade de dois indivíduos, retirados ao acaso da mesma população e não aparentados entre si, se possam diferenciar geneticamente, mediante a análise de um sistema ou conjunto de sistemas genéticos. Quanto maior for o número de sistemas genéticos considerados, maior o valor de PD, existindo maior capacidade de discriminar vários indivíduos de uma população.

34 32 Probabilidade de Matching (MP): Também conhecida como Match Probability ou Probabilidade de Coincidência, é a probabilidade de dois indivíduos terem o mesmo padrão genotípico. Portanto, é o oposto da Probabilidade de Discriminação. Heterozigosidade: Trata-se de um parâmetro que representa a probabilidade de dois alelos do mesmo locus, escolhidos ao acaso na população, serem diferentes. A heterozigosidade observada (H o ) definese como o número de indivíduos heterozigóticos observados, relativamente ao número total de indivíduos da população. A variabilidade genética de uma população é quantificada pela heterozigosidade média esperada (H e ) por locus. Este valor consiste na média aritmética dos valores de heterozigosidade dos vários loci analisados. H e difere de H o porque ela é uma previsão baseada na frequência alélica conhecida, oriunda de amostras individuais. Conteúdo Informativo de Polimorfismo (PIC): É a capacidade informativa de um locus analisando-se seu conteúdo em informação polimórfica. PIC superiores a 0,5 são considerados muito informativos.

35 33 3 JUSTIFICATIVA Até o presente momento, há poucos trabalhos no Brasil cujo enfoque esteja voltado para a construção de um banco de dados de frequências alélicas para os marcadores comumente utilizados em identificação humana, que contemplem 15 loci polimórficos ou mais, assim como uma maior quantidade de indivíduos analisados. Portanto, faz-se necessário a caracterização da população do estado do Rio Grande do Norte através da introdução de mais marcadores genético moleculares, capazes de auxiliar na resolução de identificação humana (testes de paternidade) e de medicina forense.