PCR Reação em cadeia pela DNA polimerase. Método e Aplicações. Kary Mullis 1983
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- Nicholas Osvaldo Gabeira de Lacerda
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1 PCR Reação em cadeia pela DNA polimerase Método e Aplicações DNA PCR (conhecer DNA genômico e genes) RNA RT-PCR (conhecer a expressão de um gene) qrt-pcr (quantificar a expressão de um gene) PCR em tempo real (real-time) Kary Mullis 1983
2 Lembretes 5 Orientação de uma cadeia de DNA ou RNA: extremidade 5 e extremidade 3 O 3 PO 3
3 Lembretes Exemplo de um oligonucleotídios 5 d(cgaat) Notar que é bem diferente de 5 d(taagc) As duas fitas de DNA correm em sentidos opostos
4 Lembretes Pontes de Hidrogênio na dupla hélice h A forma 2 pontes de hidrogênio com T na fita oposta G forma 3 pontes de hidrogênio com C na fita oposta 2 fitas complementares
5 A DNA polimerase necessita de um trecho de dupla fita para se ancorar e iniciar a síntese da segunda fita de polímero de DNA baseando-se na fita complementar que serve de matriz A DNA polimerase funciona sempre adicionando bases na ponta 3 portanto a fita cresce de 5 para 3 Pergunta: Então qual a direção da fita matriz?
6 dctp REAGENTES PARA PCR datp dgtp dctp dttp datp primers dntp dgtp dctp MgCl 2 Taq DNA polimerase DNA Thermus aquaticus
7 PCR Desnaturação por calor Associação dos primers primers Ação de Taq DNApolimerase Cópia Fita 5 Fita 3 G C T A
8 , , , , , , , , ,
9 Aplicação: amplificação de uma seqûencia de bases, desde que fornecidos os iniciadores (primers)) = especificidade Vantagens: utilização de diminuta quantidade de matriz Desvantagens: conhecimento prévio da sequência e amplificação de erros
10 Visão do DNA por fluorescência antes e... depois do PCR
11 acesso restrito roupa e cabelos adequados, uso de luvas e...
12 PROCESSAMENTO ÁREA 1 preparo de reagentes ÁREA 2 extração de DNA ou RNA ÁREA 3 reação de amplificação e detecção
13 fluxo laminar separação de áreas CONTROLE DE CONTAMINAÇÃO desinfecção frequente e luz ultr e luz ultravioletaavioleta ico autoclavagem do material biológico acondicionamento como lixo hospitalar
14 Aplicações Investigação forense Antropologia Paternidade Linhagens animais Identificação de Patógenos Identificação de doenças Transgenia Identificação de restos humanos Monitoramento de transplantes e pêga de enxertos
15 Seqüências repetitivas no DNA Satélites pb pouco polimórficos Minisatélites pb muito polimórficos Microsatélites 2-6 pb muito polimórficos
16 CCATG CCATG GGATTATGGTTTTT GGATTATGGTTTTT CCATGATATATATATAT ATATATATATATGGATTATGGTTTTT GGATTATGGTTTTT CCATG CCATG CCATGATATATATAT ATATATATATGGATTATGGTTTTT CCATG ATATATATATATATGGATTATGGTTTTT O que é um alelo de microsatélite? alelo 1 CCATGATATAT ATATATGGATTATGGTTTTT alelo 2 CCATGATATATAT ATATATATGGATTATGGTTTTT GGATTATGGTTTTT alelo 3 alelo 3 alelo 4 CCATGATATATATATATAT GGATTATGGTTTTT alelo 5 alelo 5 slippage slippage
17 A evidência coletada na cena do crime Blood Tissue Semen Urine Hair Teeth Saliva Bone
18 O DNA é extraído da vítima e dos suspeitos
19 Cena do Crime! Determine qual o suspeito que não pode ser excluído...
20 CCATG CCATG CCATG alelo 1 CCATGATATAT ATATATGGATTA GGATTA alelo 1 alelo 2 CCATGATATATAT ATATATATGGATTA GGATTA alelo 2 alelo 4 CCATGATATATATATAT ATATATATATATGGATTA GGATTA alelo 4
21 P M m f p p/f M m f p p/f M D4S139
22 CCATG CCATG CCATG alelo 1 CCATGATATAT ATATATGGATTA GGATTA alelo 1 alelo 2 CCATGATATATAT ATATATATGGATTA GGATTA alelo 2 alelo 4 CCATGATATATATATAT ATATATATATATGGATTA GGATTA alelo 4 alelo mutante
23 CCATG CCATG CCATG CCATG CCATG CCATG TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT Microsatélites como Marcadores de Doença Microsatélites como Marcadores de Doença alelo 1 CCATGATATAT ATATATGGATTA GGATTATG TGGTTTTT alelo 2 CCATGATATATAT ATATATATGGATTA GGATTATG TGGTTTTT alelo 2 CCATGATATATAT ATATATATGGATTA GGATTATG TGATTTTT alelo 5 CCATGATATATATATATAT ATATATATATATATGGATTA GGATTATG TGGTTTTT alelo 1 CCATGATATAT ATATATGGATTA GGATTATG TGGTTTTT TTTTT alelo 1 alelo 4 CCATGATATATATATAT ATATATATATATGGATTA GGATTATG TGGTTTTT
24 DIAGNÓSTICOS DIFÍCEIS nas meningites no recém nascido nas infecções por virus como herpes simples por microbactérias: : tuberculose HIV doenças genéticas janela imunológica
25 documentação Preparo dos reagentes para PCR amplificação eletroforese
26 análise de tecido tumoral
27 Detecção Quantitativa de HIV RT-PCR da porção 5 UT do genoma HCV com primer biotinilado adição de solução denaturante RNA + QS produto no poço: sonda de DNA interna QS * ** amostra ctrl+ ctrl- adição de avidina conjugada à peroxidase QS reação colorimétrica e leitura da placa de ELISA
28 DNA Microarrays CodeLink (20000 genes) Ilhotas Normais Tumoral - Insulinoma
29 Seqüenciamento Frederick Sanger ganhou 2 prêmios Nobel!
30 SEQUENCIAMENTO tecido tumoral p53... doenças genéticas bactérias fibrose cística hemoglobinopatias vírus: genotipagem medicina forense paternidade histocompatibilidade
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