PCR e Desenho de primers. Dra. Helen Alves Penha

Transcrição

1 PCR e Desenho de primers Dra. Helen Alves Penha 19 de Agosto de 2016

2 Objetivos da aula... PCR? Primer? Como desenhar? Como fazer? Como otimizar? Vai funcionar?

3 PCR?

4 O que é a PCR Polymerase Chain Reaction? É uma técnica que consiste em fazer cópias de DNA in vitro, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA Fonte: Google imagens Proporciona rápida amplificação de um segmento específico de DNA ou cdna Fotocopiadora molecular

5 O que é a PCR Polymerase Chain Reaction? A especificidade é dada pelo uso de primers específicos para o gene ou região do DNA de interesse Sequência-alvo A utilização de dois primers delimitam o alvo e a repetição dos ciclos da PCR dá origem a bilhões de cópias do alvo

6 Antes de entrarmos em detalhes sobre a PCR, vamos ver um pouco do seu histórico...

7 Histórico da PCR 1983 Criação da técnica por Kary Mullis 1985 Apresentação da pesquisa à comunidade cientfca e publicação na revista Science Amplificação enzimática da b-globina para o diagnóstico de anemia falciforme

8 Histórico da PCR 1985 Desenvolvimento do Mr. Cycle 1986 Taq polimerase descoberta da bactéria Termus aquaticus e extração de sua DNA polimerase Lago no parque de Yellowstone

9 Histórico da PCR 1987 Com a patente da PCR por parte da Perkin, desenvolve-se a automação para controle do aumento e redução da temperatura, neste momento surge o Termociclador 1989 Taq Polimerase PCR - Molécula do ano Science Desenvolvimento da PCR em diagnóstico

10 Histórico da PCR 1989 Foi ao ar, em 30 de janeiro de 1989, um episódio de Star Trek - The Next Generation, onde a médica comandante Katherine Pulaski foi infectada por um vírus que atacou seu DNA, e foi curada quando o DNA de sua pré-infecção foi isolado de um cabelo encontrado em sua cabine Assim, a técnica de PCR entrou na grande mídia!

11 Histórico da PCR 1993 Karry Mullis recebe o Prêmio Nobel de Química

12 Histórico da PCR 2003 Desenvolvimento da PCR em Tempo Real ou qpcr técnica de PCR na qual utiliza-se além dos primers (iniciadores de amplifcação), as sondas marcadas, possibilitando a quantifcação do alvo em estudo

13 Como fazer?

14 Detalhes da técnica de PCR convencional Replicação in vitro do DNA: Desnaturação inicial: ~4min Alternância de temperaturas a cada ciclo: Desnaturação ~1min Anelamento Polimerização ~1min

15 Reagentes utilizados na PCR Água DNA molde Nucleotídeos Primers DNA polimerase (Taq) Tampão Mg++

16 PCR Convencional - Ciclos

24 PCR Convencional - Ciclos Após sucessivos ciclos...

25 Reagentes utilizados na PCR Água DNA molde Nucleotídeos Primers DNA polimerase (Taq) Tampão Mg++

26 Reagentes utilizados na PCR DNA molde - template Quantidade mínima de DNA Complexidade do DNA de plasmídeos a genomas completos Pureza Proteínas, lipídeos, outro DNA, reagentes da extração, etc Degradação Inibidores EDTA, Heparina Contaminação produtos amplificados

27 Reagentes utilizados na PCR dntps (datp, dttp, dctp, dgtp) Em concentrações iguais Concentração fnal entre 20 e 200µM, dependendo do tamanho do segmento e duração da reação Altas concentrações afetam especifcidade dos primers

28 Reagentes utilizados na PCR Tampões Mantêm um ph ótimo para a atividade da enzima Íons diversos (Na+, CL-, K+, entre outros) Detergentes (Tween 20, Triton X, Nonidet P-40) Proteínas estabilizantes (BSA) Substâncias que agem na desnaturação da cadeia molde de DNA (DTT), quebrando as pontes de hidrogênio entre as bases

29 Reagentes utilizados na PCR Magnésio Funciona como um co-fator na atividade da Taq polimerase Utiliza-se de 1 a 4mM

30 Reagentes utilizados na PCR Taq DNA polimerase 0,4 a 1U da enzima para reações com volume de 25ul Não-proofreading Alguns erros na sequência do fragmento fnal Adiciona uma A extra às extremidades 3 do DNA Proofreading Não adiciona nucleotdeos extras Com atividade corretiva 3 5

31 Reagentes utilizados na PCR Primer? Um primer é um curto oligonucleotdeo que é reverso complementar à região do DNA molde Ele pode se anelar à fta do DNA para facilitar a amplifcação de uma sequência de DNA alvo

32 Como otimizar a PCR?

33 Otimização da PCR Para que otimizar? Aumentar o rendimento da reação - efciência Aumentar a especifcidade (especialmente quando se tem background) Aumentar a reprodutibilidade

34 Parâmetros a serem otimizados Concentração dos reagentes Componentes do tampão Condições dos ciclos Desenho dos primers Especificidade Rendimento Mg++ menor maior Primers menor maior Ta maior menor

35 Otimização da PCR Fidelidade Rendimento

36 Primer? Como desenhar? Vai funcionar?

37 Desenho dos primers

38 Desenho dos primers As primeiras reações de PCR utilizavam primers projetados manualmente, ou seja, baseados inicialmente apenas na sua complementaridade com a seqüência alvo Primeiro passo obtenção da sequência a qual deseja se amplificar

39 Desenho dos primers Tamanho dos primers Determina especificidade e afeta seu anelamento com o DNA molde! Muito curto -> baixa especifcidade, resultando em amplifcação não específca Muito longo -> diminui a efciência de ligação ao DNA molde em temperatura normal de anelamento devido à maior probabilidade de formação de estruturas secundárias, como grampos

40 Desenho dos primers Tamanho dos primers Normalmente de 18 a 28 bases Probabilidade de encontrar uma das 4 bases no DNA - ¼; Probabilidade de encontrar um dinucleotdeo qualquer 1/16; Probabilidade de encontrar uma qualquer seqüência de 4 bases - 1/256; Probabilidade de encontrar uma qualquer seqüência de 16 bases 1/

41 Desenho dos primers Tamanho do amplicon bp para PCR comum, evitar >3 kb Evitar amplicons muito curtos para poder distinguí-los de possíveis dímeros de primers!

42 Desenho dos primers Temperatura de Melting A temperatura na qual 50% da dupla fita de DNA se dissocia para fita simples Determinado pelo comprimento, composição de base e concentração dos primers e pela concentração de sal no mix da PCR

43 Desenho dos primers Temperatura de Melting Cálculo aproximado: Tm = 2(A+T) + 4(G+C) C (indicado para <18mer) Utilizado para cálcular a temperatura de anelamento (Ta): Ta Opt = 0.3 x(tm of primer) x(tm of PCR product) 25 Regra geral: Ta = Tm-5 C

44 Desenho dos primers Temperatura de Anelamento Ta ótima 52 C - 60 C Ta baixo aumenta a efciência da PCR mas diminui a especifcidade Ta alto aumenta a especifcidade mas diminui efciência da PCR Ta >65 C pode ser recomendado para a amplifcação de alvos com elevado conteúdo de GC

45 Desenho dos primers Temperatura de Anelamento Diferenças de Ta entre o par de primers Incompatibilidade signifcativa do par de primers pode levar à má amplifcação Desejável diferença Ta <5 C

46 Desenho dos primers Conteúdo GC e repetições Conteúdo G/C do primer Conteúdo ideal de G/C: 45-55% Conteúdo semelhante para o par de primers Recomendado C ou G na extremidade 3 (aumentar efciência ligação) Runs (repetições de base única, ex aaaaaaa) Repetições longas aumenta o potencial de anelamento inespecífco O número máximo aceitável de repetições é de 4 bp

47 Desenho dos primers Conteúdo GC e repetições Repetições (repetições de di-nucleotídeos consecutivas, ex. acacacac) Repetições aumenta o potencial de anelamento incorreto/inespecífco O número máximo de repetições aceitável é de 4 dinucleotdeos

48 Desenho dos primers Bases na região 3 dos primers Os primers deverão terminar na posição 3' com um G ou C, ou CG ou GC: aumenta a estabilidade anelamento Não se deve ter mais do que três G ou C na posição 3, pois pode ocorrer anelamento não específco do primer Não se deve ter A ou T na região 3, pois o mesmo não dará estabilidade no pareamento

49 Desenho dos primers Especificidade e homologia cruzada Especificidade Determinada principalmente pelo comprimento do primer assim como sua sequência A adequação da especifcidade do primer é relativo à natureza do DNA molde utilizado na reação de PCR

50 Desenho dos primers Especificidade e homologia cruzada Homologia Cruzada Pode ser um problema quando o molde de PCR é o DNA genômico ou consiste de fragmentos de genes mistos Os primers contendo a sequência altamente repetitiva são propensos a gerar produtos de amplifcação não específcos, quando a amplifcação de DNA genômico

51 Desenho dos primers Para evitar amplificação não específica... Além da temperatura e comprimento ideal dos primers: BLAST dos iniciadores contra banco de dados NCBI de sequência não-redundante é uma maneira comum de evitar desenhar primers que podem amplifcar regiões homólogas inespecífcas

52 Desenho dos primers Complementaridade - Estruturas 2árias dos primers Atrapalham a ligação primer-molde, levando a pouca ou nenhuma amplifcação Análise de ΔG aceitável (energia livre necessária para quebrar a estrutura) Grampos Formados por interações intra-moleculares no mesmo primer

53 Desenho dos primers Complementaridade - Estruturas 2árias dos primers Auto-dímero (homodímero) Formado por interações inter-moleculares entre dois iniciadores iguais Cross-dímero (heterodímero) Formado por interações inter-moleculares entre os primers sense e antisense

54 Desenho dos primers Com bases nestas informações, vamos desenhar um par de primers manualmente? Atividade prática 1

55 Desenho dos primers Lembrando de alguns parâmetros básicos... Primer Foward no sentido da fita senso Primer Reverse no sentido reverso complementar da fita senso Tamanho dos primers preferencialmente entre 18 a 22b Tamanho do amplicon Conteúdo GC (%) 40 a 60 Tm 45 a 60oC Diferença de Tm entre primers no máximo 5oC

56 Desenho dos primers Agora vamos aprender a desenhar um par de primers utilizando softwares?

57 Como desenhar primers utilizando softwares? Primeiro passo obtenção do arquivo da sequência no formato fasta NR_

58 Desenho dos primers Primeiro passo obtenção do arquivo da sequência no formato fasta >gi ref NR_ Xanthomonas axonopodis pv. citri str. 306 strain S ribosomal RNA, complete sequence TAAGTGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAGTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACAGTAAGAGCTTGC TCTTATGGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATACATCGGAATCTACTCTTTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACC GCATACGACCTACGGGTGAAAGCGGAGGACCTTCGGGCTTCGCGCGGTTGAATGAGCCGATGTCGGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAAA GGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGC AGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGGGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCCCTTTT GTTGGGAAAGAAAAGCAGTCGGTTAATACCCGATTGTTCTGACGGTACCCAAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTGGTTTAAGTCTGTTGTGAAAGCCCTGGGC TCAACCTGGGAATTGCAGTGGATACTGGGTCACTAGAGTGTGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCCGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGAT CGGGAGGAACATCCGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGACCAACACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATA CCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGTGCAATTTGGCACGCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACG CGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACGGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCT GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTC TAAGGAGACCGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTACTAC AATGGTAGGGACAGAGGGCTGCAAACCCGCGAGGGCAAGCCAATCCCAGAAACCCTATCTCAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACT CCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGG GAGTTTGTTGCACCAGAAGCAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTGCCACGGTGTGGCCGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAG GTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT

59 Desenho dos primers Inserir a sequência de DNA Demarcar a região a ser amplificada Inserir o tamanho dos primers Tm 4560oC N Excluir primers S % GC 4060 Lista de primers aceitáveis N S S Região 3 estável N Estrutura secundária S

60 Desenho dos primers Existem muitas ferramentas disponíveis na internet que facilitam o desenho dos primers AutoPrime IDT AntiSense Design CODEHOP NetPrimer UCSC In-Silico PCR IDT Oligo Analyzer PrimeX Gene Runner Primo Pro ExonPrimer Web Primer Oligonucleotide Analyzer Primer3 IDT PrimerQuest

61 Desenho dos primers Desenho dos primers que amplifiquem a sequência alvo

63 Desenho dos primers Selecionar da base 771 até a pb

72 Desenho dos primers Os primers deverão terminar na posição 3' com um G ou C, ou CG ou GC: aumenta a estabilidade anelamento, Não se deve ter mais do que três G ou C na posição 3, pois pode ocorrer anelamento não específco do primer, Não se deve ter A ou T na região 3, pois o mesmo não dará estabilidade no pareamento.

73 Desenho dos primers Análise da formação de estruturas secundárias nos primers

74 Desenho dos primers Análise da formação de estruturas secundárias nos primers Programa Gene Runner

75 Desenho dos primers Análise da formação de estruturas secundárias nos primers Programa Gene Runner dg= - 4 Kcal/mol- rendimento de 70% dg= - 8 Kcal/mol - rendimento de 20% dg= -12 Kcal/mol não ocorre amplificação

76 Desenho de primers Atividade prática 2 Desenhar um par de primers para uma região contendo um microssatélite

77 Desenho de primers Desenhar um par de primers para uma região do genoma de Passiflora edulis f. flavicarpa contendo um microssatélite FJ CTCTCTCTCTCTCTCCTCCCTCTCTCTCTCCTCCTTCTCTCTCTCTCTCCT Anotar: Sequência dos primers F e R, no sentido 5-3, tamanho do amplicon, %GC, Tm, diferença de Tm entre os primers, Formação de estrutura secundária, calcular provável Ta

78 Desenho de primers Inserir a sequência de DNA Demarcar a região a ser amplificada Inserir o tamanho dos primers Tm 4560oC N Excluir primers S % GC 4060 Lista de primers aceitáveis N S S Região 3 estável N Estrutura secundária S

79 Desenho de primers Atividade prática 3 Desenhar um par de primers para amplificar uma região barcode de cloroplastos

80 Desenho de primers Desenhar um par de primers para uma região barcode de Prunus persica AF A região que deve ser amplifcada está entre a base 592 a 736 Anotar: Sequência dos primers F e R, no sentido 5-3, tamanho do amplicon, %GC, Tm, diferença de Tm entre os primers, Formação de estrutura secundária, calcular provável Ta

82 Desenho de primers Atividade prática 4 Desenhar um par de primers para amplificar um gene específico

83 Desenho de primers Desenhar um par de primers para amplificar SOMENTE o gene FGF5 (fibroblast growth factor 5) de Canis lupus familiaris DQ Anotar: Sequência dos primers F e R, no sentido 5-3, tamanho do amplicon, %GC, Tm, diferença de Tm entre os primers, Formação de estrutura secundária, calcular provável Ta

85 Desenho de primers Vamos conferir se o par de primers que vc desenhou ficou bom?

86 Dúvidas??

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