Variabilidade genética e endogamia em populações de tucunaré azul (Cichla piquiti) no Reservatório de Serra da Mesa (norte de Goiás)

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1 Variabilidade genética e endogamia em populações de tucunaré azul (Cichla piquiti) no Reservatório de Serra da Mesa (norte de Goiás) Faquim R. C. P.; Caramori S. S.; Carvalho A. R.; Telles M. P. C. & Resende L. V. Universidade Estadual de Goiás, Unidade de Ciências Exatas e Tecnológicas. CEP Brasil. s: samantha.salomao@ueg.br / ruan_faquim@hotmail.com Palavras-Chave: Cichla piquiti, variabilidade genética, endogamia e microssatélite. 1 INTRODUÇÃO As espécies de tucunaré (Cichla sp) são provenientes da Bacia Amazônica e do Rio Tocantins-Araguaia e são espécies introduzidas em várias áreas das regiões tropicais e subtropicais, devido ao valor econômico ligado a pesca esportiva e ao consumo humano. Para a pesca profissional e esportiva, o tucunaré é muito valorizado devido à agressividade que demonstra ao ser capturado (GOMEIRO et al., 2009). Tucunarés são peixes sedentários e com hábitos diurnos que se alimentam de qualquer organismo pequeno em movimento, como outros peixes ou até pequenos crustáceos e, ao contrário da maioria dos peixes da Amazônia, os tucunarés perseguem a presa até conseguir o sucesso de captura (SANTOS et al., 2001). Durante a sua reprodução formam-se casais que partilham a responsabilidade de proteger o ninho, já os ovos e os juvenis, permanecem em ambientes lacustres ou mesmo em rios ou estuários, embora nestes últimos haja a preferências por zonas de águas lentas ou paradas (SANTOS et al., 2001). Devido ao comportamento agressivo e territorialista, em especial em época reprodutiva e por não ser uma espécie caracteristicamente migratória, é possível que populações de lagos e rios exibam separação genética, ainda que tenham conexão entre si (GOMEIRO et al., 2009). 1

2 Por serem nativas do Reservatório de Serra da Mesa, essas espécies são alvo de pesca desde a formação do lago. Mesmo havendo várias populações locais não se sabe se há distinção genética dentro e entre as populações em decorrência da pesca e formação de barreiras decorrentes da inundação (CARVALHO et al., 2009). Uma das técnicas mais utilizadas atualmente para análise de populações é o estudo de regiões microssatélites do DNA; partes do cromossomo compostas por grandes repetições de pares de base em sequência e que tem sido amplamente utilizada para o monitoramento genético em peixes, tais como, sistema de cruzamento, fluxo gênico e estrutura genética dos estoques (YUE & ORBAN, 2002). Tais marcadores podem ser empregados também para estimativas dos coeficientes de endocruzamento e parentesco, possibilitando assim identificar possíveis relações genéticas entre a geração parental e progênie (FESSEHAYE et al., 2006). Por esta razão, o objetivo deste trabalho foi otimizar os dez locos encontrados na literatura para Cichla piquiti e verificar se existe variação genética entre as populações de tucunarés coletados nos diferentes habitats do Reservatório de Serra da Mesa. 2 MATERIAIS E MÉTODOS Foram feitas duas amostragens durante o período de novembro de 2009 e junho de 2010, com aproximadamente oito dias cada. A área de estudo foi dividida em sete pontos de coletas localizados em quatro rios tributários no Reservatório de Serra da Mesa: Rio Bagagem, Rio Maranhão, Rio Tocantizinho e Rio Traíras. Para a coleta dos tucunarés foram utilizadas redes de malhas com dez diferentes tamanhos: 2.4, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, e 16 cm. As redes foram colocadas tanto no período diurno quanto no período noturno, revisadas a cada doze horas. A quantidade de indivíduos recolhida em cada ponto variou de 1 a 20, totalizando no final das amostragens 60 indivíduos. Para cada um dos indivíduos capturados foi recolhido uma amostra de músculo situado na parte inferior da nadadeira dorsal. Estas estruturas foram 2

3 mantidas em álcool 96% para melhor preservação do material genético do animal (PERIOTO, 2004). 2.1 Metodologia para análise molecular Foram testados vários protocolos de extração de DNA, a partir de tecido animal,destes protocolos, o que apresentou melhor eficiência foi o protocolo sugerido por TAGGART et al. (1992). Na extração do DNA utilizou-se cerca de 1cm 3 de músculo, conservado em etanol 96%. A extração de DNA total foi feita conforme o protocolo proposto por TAGGART et al. (1992). Para verificar a quantidade e qualidade do DNA, este foi submetido corrida em gel de agarose 1%, com tampão TBE 1X (Tris ácido bórico), corado com brometo de etídio e fotografado com utilização de luz UV. A eletroforese foi conduzida em 80 V por aproximadamente 60 minutos em cuba horizontal. O DNA dos 60 indivíduos foi diluído de acordo com a quantidade ideal para as reações de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), foram otimizados através de reações de PCR um total de 10 primers desenvolvidos para a espécie Cichla piquiti, utilizando três indivíduos,independentemente do nível de polimorfismo de cada loci, mas para as análises utilizou-se apenas três primers. Embora todos os locos tenham sido desenvolvidos para a espécie específica e já existam as temperaturas de anelamento (Tm) indicadas para cada um deles, existe a necessidade de ajustes para as condições de amplificação do laboratório. Portanto, para todos os locos, foram realizados diversos testes a fim de escolher a temperatura de anelamento e quantidade de reagentes que permitisse o melhor padrão e a melhor resolução das bandas no gel. Em seguida, o DNA de todos os indivíduos foram então amplificado via reação em cadeia da polimerase (PCR) com as temperaturas de anelamento ideais para cada um dos três loco. Estas reações de PCR foram submetidas, então, à eletroforese vertical em gel de acrilamida com a utilização de um marcador Ladder 10bp (Invitrogen TM ), que apresenta uma faixa de fragmentos de tamanhos que variam entre 10pb e 330pb, com intervalo de 10pb. A corrida foi feita a 90W por aproximadamente 2 3

4 horas. Em seguida, os fragmentos foram corados com nitrato de prata para a visualização dos alelos seguindo o protocolo descrito por CRESTE et al. (2001). A partir da codificação dos géis de acrilamida com os três primers nos 60 indivíduos, foi construída uma matriz de dados com os genótipos, que foi utilizada para realizar análises nos softwares Identity 1.0 e PopGene 1.31, para verificar a frequência alélica, heterozigosidade e homozigosidade esperada e observada, porcentagem de polimorfismo de cada loco, probabilidade de exclusão de paternidade e probabilidade de identidade. 3 Resultados e Discussão A partir dos resultados obtidos com os testes de otimização dos 10 primers com três indivíduos foi possível otimizar as temperaturas de anelamento ideal para cada um dos locos. As temperaturas de anelamento variaram para cada primers de acordo com a Tabela 1. Tabela 1 - Temperatura otimizada para os dez primers de Tucunaré (Cichla piquiti) coletados no Reservatório de Serra da Mesa. Primers Temperatura Encontrada ºC Tuc ºC Tuc ºC Tuc ºC Tuc ºC Tuc ºC Tuc ºC Tuc ºC Tuc ºC Tuc ºC Tuc ºC Dos dez primers otimizados, apenas três foram utilizados neste trabalho, devido ao tempo empregado na otimização do primers e de um protocolo de 4

5 extração que fosse satisfatório e adequado ao músculo do animal em foco, o tempo restante não foi suficiente para que as populações obtidas até o momento (num total de 60 indivíduos) fossem analisadas para estes dez primers propostos. Para os três locos analisados foram encontrados um total de 9 alelos, variando de entre 1 e 6, variando de 194 a 272 pares de bases (Tabela 2).O grau de heterozigosidade esperado (He) variou de 0,5 a 0, e heterozigosidade observada (Ho) variando entre 1 e 0 de acordo com a Tabela 2. Tabela 2: Representação da variação de alelo por loco (AVA pb), número de alelo por loco (NA), heterozigosidade esperada (He), heterozigosidades observada (Ho), exclusão de paternidade (PE) e probabilidade de identidade (PI) para os três primers de Cichla piquiti do reservatório de Serra da Mesa. Locos AVA(pb) NA He Ho PE PI Primer , , Primer a , Primer , Com a utilização de todos os 60 indivíduos coletados, a probabilidade de exclusão de uma falsa paternidade (PE) foi analisada para os indivíduos através dos locos 1, 2 e 3, que apresentaram respectivamente os seguintes resultados , e 0.0. Para uma análise exclusão combinada conjunta entre os três locos (PEC) obteve-se um resultado igual a Para que um microsatélite seja considerado um bom marcador de análise para vínculo genético ele deve apresentar altos valores de probabilidade de exclusão (PE), o que corresponde a valores de PE maiores que 50% (RODRIGUES et al. 2002). Assim, os resultados mostram que estes não são locos bons para exclusão de paternidade para estes indivíduos. Ao se observar a probabilidade de identidade (PI), que representa a chance de dois indivíduos escolhidos aleatoriamente terem genótipos idênticos para todos os locos, a análise apresentou resultados como , e 5

6 , de acordo com a ordem dos locos 1, 2 e 3. Assim ao fazer uma análise para os três locos conjuntos, obteve-se o resultado de 0, Analisando os locos por pontos de coleta ou subpopulações, dividimos os 60 indivíduos em seis subpopulações, excluindo um indivíduo das análises, pois era o único representante do ponto de coleta quatro. Para o Tuc 13 nas 6 populações analisadas não foi encontrado nenhum polimorfismos, ou seja, todos os 59 indivíduos analisados apresentaram um alelo com 239 pares de base, assim a frequência do alelo A foi de 1 para todas as populações e para os outros locos as freqüências alélicas variaram entre as populações, por apresentarem mais de dois alelos (Tabelas 3, 4, 5, 6, 7 e 8). Tabela 3: Representação da frequência alélica da população 1 em tucunarés do Frequência Alélica - População 1 Alelo A Alelo B Alelo D Tabela 4: Representação da frequência alélica da população 2 em tucunarés do Frequência Alélica - População 2 Alelo A Alelo B Alelo D 6

7 Tabela 5: Representação da frequência alélica da população 3 em tucunarés do Frequência Alélica - População 3 Alelo A Alelo B Alelo C Tabela 6: Representação da frequência alélica da população 5 em tucunarés do Frequência Alélica - População 5 Alelo A Alelo B Alelo C Alelo D Tabela 7: Representação da frequência alélica da população 6 em tucunarés do Frequência Alélica - População 6 Alelo A Alelo B

8 Tabela 8: Representação da frequência alélica da população 7 em tucunarés do Frequência Alélica - População 7 Alelo A Alelo B Alelo E Alelo F CONCLUSÃO Com base nos resultados obtidos através da análise dos 60 indivíduos, foi encontrado um baixo grau de variabilidade para os lócus analisados, visto que para os três locos analisados apenas o loco Tuc 5 apresentou polimorfismo satisfatório. Para um resultado conclusivo será necessário análises de mais locos, com uma maior quantidade de indivíduos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CARVALHO, D. C.; OLIVEIRA, A. A.; SAMPAIO, I.; BEHEREGARAY, B Microsatellite markers for the Amazon peacock bass (Cichla piquiti). Molecular Ecology Resources. Vol. (9) CRESTE, S.; TULMANN NETO, A.; FIGUEIRA, A Detection of Single Sequence Repeat Polymorphisms in Denaturing Polyacrylamide Sequencing Gels by Silver Staining. Plant Molecular Biology Reporter, Vol.(19) DANTAS, A. C. M.Protocolos - Marcadores Moleculares. Acesso em: 26\01\2010 Disponível em: FESSEHAYE, Y.; EL-BIALY, Z.; REZK, M. A.; CROOIJMANS, R.; BOVERNHUIS, H.; KOMEN, H Mating systems and male reproductive success in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) in breeding hapas: a microsatellite analysis. Aquaculture. Vol.(256)

9 GOMEIRO, L. M.; VILLARES JUNIOR G. A.; NAOUS F Pesca experimental do tucunaré Cichla kelberi kullander Introduzido em um lago artificial no sudeste brasileiro. Rev. Bras. Eng. Pesca 4(2) SANTOS, L. N.; GONZALEZ, A. F.; ARAÚJO, F. G Dieta do tucunaré-amarelo Cichla monoculus (Bloch & Schneider) (Osteichthyes, Cichlidae), no Reservatório de Lajes, Rio de aneiro, Brasil. Rev. Bras. Zool. Vol. (18). TAGGART, J.B.; HYNES, R.A.; PRODÖUHL, P.A.; FERGUSON, A. A A simplified protocol for routine total DNA isolation from salmonid fishes. Journal of Fish Biology, vol.(40), THIENGO, S. C.; SANTOS, S. B.; FERNANDEZ, M. A Malacofauna límnica da área de influência do lago da usina hidrelétrica de Serra da Mesa, Goiás, Brasil. I. Estudo qualitativo. Rev. Bras. Zool. vol.(22), N (4). YUE, G. H.; ORBAN, L Microsatellites from genes show polymorphism in two related Oreochromis species. Molecular Ecology Notes. Vol (2)