A TÉCNICA DE ANÁLISE DOS LOCI STR PRESENTES NO CROMOSSOMA X AJUDA A RESOLVER PROBLEMAS NOS TESTES DE PATERNIDADE

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1 A TÉCNICA DE ANÁLISE DOS LOCI STR PRESENTES NO CROMOSSOMA X AJUDA A RESOLVER PROBLEMAS NOS TESTES DE PATERNIDADE Técnicos superiores do Departamento de Ciências Forenses da PJ Sa Fei e Wu Kit Ian Resumo: No teste de paternidade há uma limitação relativamente aos casos de pai-filha, mãe-filho, irmãos germanos e irmãos consanguíneos ou uterinos, só com o resultado do exame dos loci STR autossómicos não é possível chegar obviamente a uma conclusão, e como os loci STR presentes no cromossoma X possuem estrutura e características genéticas específicas, são utilizados em testes de paternidade duvidosos e complicados. Nos últimos anos, o nosso departamento tem introduzido a técnica de análise dos loci STR presentes no cromossoma X, com a qual se pode ampliar, de forma única, até 12 loci X-STR e depois usar o analisador genético para proceder à electroforese capilar de isolamento e à análise por fluorescência, obtem-se assim a tipificação dos loci X-STR examinados. Neste artigo destaca-se essencialmente a utilização desta técnica de análise dos loci STR presentes em cromossoma X para resolver com êxito três casos de teste de paternidade duvidosos e complexos, designadamente teste de paternidade trio convencional, teste de paternidade duo, com a ausência da amostra da mãe e teste de paternidade com vínculos complicados. Palavras chave: X-STR, teste de paternidade, técnica de análise de ADN na medicina forense I. O SIGNIFICADO DOS LOCI STR PRESENTES NO CROMOSSOMA X NA TÉCNICA DE ANÁLISE DE ADN NA MEDICINA FORENSE O short tandem repeat - STR, também conhecido por microssatélite de ADN, como é uma técnica de análise simples e rápida, oferece resultados credíveis, alta sensibilidade e tem repetibilidade, estas são as razões que o levaram a ser o principal método usado para identificar indivíduos e realizar testes de paternidade no universo das ciências forenses a nível internacional. As células do ser humano contêm 22 pares de cromossomas autossómicos e um par de cromossomas sexuais, X e Y. O cromossoma X humano tem cerca de 155Mb de comprimento e 1098 genes, o que corresponde aproximadamente a 5% do genoma total, os loci STR presentes no cromossoma X, são referidos como X-STR. O desenvolvimento e o uso do X-STR podem considerar-se como complemento de outros marcadores genéticos destinados à identificação de indivíduos e realização de testes de paternidade na medicina forense. Em termos de transmissão de alelos, o cromossoma X traduz-se no cruzamento genético e herança ligada ao sexo, o alelo do cromossoma X é transmitido pela mãe, de forma aleatória, tanto ao filho como à filha, enquanto que o alelo do cromossoma X do pai transmite-se somente para a filha. 62

2 Dado que os cromossomas sexuais masculinos são X e Y e os femininos são XX, neste sentido, aplica-se a electroforese capilar para proceder a sexagem do marcador genético. Uma vez que o cromossoma X possui um modo genético específico, os testes relativos a pai-filha, mãe-filho, irmãos germanos e irmãos consanguíneos ou uterinos entre outras relações de parentesco possuem vantagens incomparáveis com outros marcadores genéticos e merecem destaque no domínio dos testes de ADN na medicina forense. II. ANÁLISE DOS LOCI STR PRESENTES NO CROMOSSOMA X NA APLICAÇÃO EM TESTES DE PATERNIDADE DUVIDOSOS Figura 1: Os loci X-STR frequentemente usados na análise do ADN na medicina forense a nível internacional, presentes no grupo de ligação 1 4 do cromossoma X. Desde 2001, a Polícia Judiciária tem começado a usar o método de tipificação do ADN para efectuar testes de paternidade solicitados pelas autoridades judiciárias, nomeadamente o Ministério Público ou os tribunais, e por órgãos administrativos como a Conservatória do Registo Civil ou a Direcção dos Serviços de Identificação. Atendendo às constantes mudanças tecnológicas, esta instituição colabora activamente com a Secretaria para a Segurança, para seguir o conceito de reforço do trabalho policial com a utilização da tecnologia, tem acompanhado o evoluir dos tempos, e ao longo dos anos, tem introduzido técnicas forenses mais actualizadas e credíveis de modo a proporcionar serviços de peritagem material e realizar testes de paternidade de melhor qualidade. Existem dificuldades em muitos testes de paternidade devido ao grau de complexidade ou limitação das técnicas de análise, por isso, pretendemos apresentar neste artigo, três dos casos 63

3 duvidosos que foram resolvidos graças à introdução da técnica de análise dos loci STR presentes no cromossoma X. 1) Caso 1: trata-se de um teste de paternidade trio convencional. Os examinandos foram o pretenso pai, a mãe e a menina, o objectivo desta análise era verificar se o indivíduo era de facto o pai biológico da menor. Conforme o Mapa I, dos resultados obtidos nos exames dos 15 loci autossómicos regulares verificam-se que todos os loci da mãe e da menina obedecem às leis de herança genética de Mendel, contudo os loci D3S1358 e D8S1179 do suposto pai não obedecem a esta regra. Nos testes de paternidade só se considera a exclusão de paternidade quando houver três ou mais loci genéticos do suposto pai e da criança que não obedecessem àquela lei. Porém neste caso, só havia dois loci que não correspondiam à regra genética, deste modo não se podia excluir que o indivíduo pudesse ser o pai biológico da criança, isto revela a limitação da análise dos 15 loci autossómicos, o que aumenta as dificuldades dos peritos em determinar e de esclarecer os resultados dos exames. A mutação genética nos testes de paternidade surge muitas vezes no aumento ou diminuição de uma sequência repetitiva na genotipagem, tendo como principais causas, a mutação do sítio de ligação do iniciador, a do cromossoma e o estado de quimerismo das células submetidas ao exame ou à existência de células malignas que também fazem com que os loci analisados desviem das leis de Mandel. Para obter um resultado objectivo, analisamos mais 4 loci autossómicos e ao mesmo tempo, utilizamos a nova técnica de análise dos loci X-STR o que nos permitiu obter 12 genotipagem loci X-STR dos examinandos. Num total de 19 loci autossómicos e 12 loci X-STR verificamos que houve, respectivamente, três loci do suposto pai e da menina que não obedecem à regra, isto levou à conclusão que neste caso pode-se excluir a paternidade. A análise deste caso indicou-nos que quando se utilizam autossomas para realizar uma análise de paternidade, e se há um ou dois loci que não obedecem às leis da herança genética, podese recorrer aos loci X-STR para chegar a uma conclusão mais clara, visto que os loci X-STR servem como meio de auxílio para resolver casos de mutação autossómica. 2) Caso 2: trata-se de um teste de paternidade duo, sem amostras da mãe, as pessoas sujeitas ao teste eram o suposto pai e a menina, sendo o objectivo do teste verificar se o indivíduo era pai biológico da menina. O resultado do exame dos 19 loci autossómicos mostrava que os loci Penta D e D12S391 presentes na amostra do suposto pai e da criança não obedeciam às leis de herança genética. Perante este resultado, o perito deste exame não conseguiu tirar uma conclusão clara do exame, por esta razão foi necessário efectuar exames noutros loci. Depois de ter feito o exame a 12 loci X-STR, o resultado mostrou que o suposto pai e a criança tinham 6 loci X-STR a não obedecer às leis de herança genética, o que significa que o indivíduo não é o pai biológico da menina, por conseguinte, na investigação criminal apurou-se que o suposto pai, do caso 2, é na realidade um tio que fingiu ser o pai biológico da menina para realizar o teste de paternidade. A ausência das amostras da mãe para comparação, que 64

4 poderiam servir de referência, dificultou este teste, e o teste de paternidade de família monoparental é uma parte importante do teste de paternidade civil, não é estranho surgir nos testes de paternidade de família monoparental um ou dois pares de loci que não obedecem às leis de herança genética, face a este tipo de situação é necessário recorrer a mais análises de marcadores genéticos, para garantir a fiabilidade dos resultados. No caso do teste de paternidade duo, a análise do X-STR é pouco significativo para determinar o vínculo entre pai e filho; em relação ao vínculo entre mãe e filha, o X-STR também não é fundamental relativamente aos cromossomas autossómicos. Contudo, relativamente ao teste do vínculo entre pai e filha, o X-STR é um método de exclusão bastante eficaz, uma vez que os loci X-STR são sempre herdados do pai biológico para a filha, se os alelos dos loci X-STR da filha forem diferentes dos do suposto pai, pode-se excluir directamente a existência do vínculo entre pai e filha; ao proceder ao teste do vínculo entre mãe e filho, X-STR é mais eficaz que o STR dos cromossomas autossómicos, a sua probabilidade de exclusão é igual a do teste do vínculo entre pai e filha com recurso a X-STR. Nos testes de paternidade duo, a utilização do X-STR traz grandes vantagens. 3) Caso 3, trata-se de duas irmãs consanguíneas que foram submetidas aos testes de paternidade, sem haver amostras do pai. Examinaram-se amostras das duas meninas e da mãe com o objectivo de apurar se as mesmas eram de facto filhas do mesmo pai. Neste caso, só analisando os STR dos cromossomas autossómicos não seria possível excluir os seus vínculos assim como o marcador genético mitocondrial não foi suficiente para provar se aquelas eram irmãs procedentes do mesmo pai, pois as irmãs do mesmo pai, independentemente de serem irmãs uterinas ou consanguíneas, possuem o mesmo cromossoma X vindo do pai, por isso, a análise dos loci X-STR pode resolver este problema, e como se refere no mapa I, pode-se concluir que as duas possuem os mesmos alelos X-STR do pai, depois de retirar os alelos X-STR da mãe de cada uma delas, através da análise dos loci X-STR das irmãs, pode-se afirmar que não se exclui que as duas tenham o mesmo pai biológico. Da análise dos loci STR autossómicos regulares não foi possível excluir o vínculo das irmãs consanguíneas, foi assim necessário recorrer a análise dos loci X-STR. Para além dos 3 casos duvidosos referidos neste artigo, nalguns casos de incesto, quando dois alegados pais têm uma relação de pai e filho, como não existe uma correlação X-STR neste tipo de ligação, os dois passam a ser considerados indivíduos sem vínculo, procede-se assim à análise da possível paternidade de cada um deles da alegada filha. Noutro caso do género em que o alegado pai poderá ser pai da mãe biológica, pode ser feita a análise de acordo com a menina em causa e os seus pais biológicos para verificar se se encontra o mesmo alelo do X-STR, a fim de proceder à hipótese de exclusão. Deve-se ter cuidado com um factor, há uma certa limitação dos loci STR presentes em cromossoma X independentemente da boa eficiência do sistema STR do cromossoma X, por isso devem-se utilizar com cautela os marcadores genéticos do cromossoma X em testes de 65

5 Loci STR dos cromossomas autossómicos Loci X-ST Loci STR Caso 1 Caso 2 Caso 3 Suposto pai Mãe Menina Suposto pai Menina Mãe 1 Menina 1 Mãe 2 Menina 2 D3S ,17 16,17 15,17 16,17 15,17 16,19 16, ,16 TH01 6,7 7,9 7,9 9 7,9 7,9 7,9.3 6,9 9,9.3 D21S11 29,30 29, , ,35 28,35 29, ,31.2 D18S51 15,17 13,15 13,17 15,16 14,15 12, ,15 14,15 Penta E 15,18 11,15 11,15 11, ,15 13, ,15 D5S818 12,13 11,12 12,13 9, ,13 11,13 11,12 11,12 D13S317 8, ,12 9,12 10,11 8, D7S820 8,9.2 8,11 9.2, ,12 12,14 10,11 8,10 D16S539 8, ,12 10, ,12 11,12 9,12 11,12 CSF1PO 10,12 7,9 7, , ,12 11,12 Penta D 10,11 8,12 10,12 11,14 9,12 8,12 12,13 9,11 11,13 vwa 14 15,17 14,15 18,19 16,19 17,19 14,17 14,17 17,18 D8S , ,13 12,14 11, ,15 11,13 12,13 TPOX 9,10 8,12 9,12 8,11 8,11 8,11 8, ,11 FGA 22,25 18,19 19,25 23,24 23,25 19,22 19,21 23,24 21,24 D2S ,24 17,24 17,22 18,23 18,20 D19S433 11, ,13 13, ,13 D12S391 18,20 19, ,22 20,21 D6S ,18 18,19 18,19 12,14 14,18 DXS ,18 16, ,19 16,18 16, ,20 DXS ,11 10, ,11 10,12 10,11 10,11 11 DXS , ,16 14, ,15 DXS , , ,39 36,39 35,38 35,36 DXS ,18 15, ,17 17,18 7,18 16,18 7,18 DXS , , ,33 30, ,33 30, ,31.2 DXS , ,35 23,26 19,23 24,29 19,29 DXS , ,15 15, ,15 15 DXS , ,33 30,33 29,31 30,31 DXS ,20 19, ,20 19,20 16,19 16,20 HPRTB 14 12,13 12, , ,13 12,14 11,14 DXS , , , , , ,26.1 Amelogenin X,Y X X X,Y X X X X X Tabela 3: A tipificação dos 19 loci STR dos cromossomas autossómicos e 12 loci X-STR de cada examinado dos três casos de testes de paternidade. (Os números a vermelho são as tipificações que não obedecem às leis de herança genética) paternidade complicados. Essas limitações são as seguintes: primeiro, até este momento o número de loci X-STR que foi descoberto e aplicado é reduzido, há uma falta de informações no que diz respeito à distribuição das camadas, taxa de mutação, equilíbrio de ligação e variação da estrutura genética; segundo, as análises de X-STR apenas servem para fazer exclusões e para obter um resultado objectivo, é necessário ter uma combinação dos marcadores genéticos com autossomas, cromossomas Y e mitocondrial, enquanto que os loci STR presentes no cromossoma X servem apenas como elementos complementares essenciais desses marcadores genéticos, por último, há homologia de sequência entre os loci STR, os cromossomas Y e os loci STR autossómicos, por isso devem excluir-se interferências ao utilizá-los. 66

6 III. CONCLUSÃO Desta forma, com o aumento dos tipos e do número de casos complicados de teste de paternidade, os loci X-STR do ser humano merecem atenção e importância por parte dos peritos da medicina forense por serem marcadores genéticos específicos que possuem vantagens específicas, e são ainda elementos complementares essenciais na tipificação STR dos cromossomas autossómicos e do ADN mitocondrial. Para proceder de forma precisa, rápida e eficiente ao teste de vínculo genético entre irmãos, obtendo-se resultados mais exactos, basta utilizar conjuntamente o sistema STR altamente polimórficos, tentar recolher mais informações genéticas e realizar análises globais, não obstante haja eventuais insuficiências em teste de STR singular. Com a evolução da tecnologia e o empenho dos investigadores desta área, o X-STR é um método emergente e relevante da biologia molecular, desempenha um papel importante não só nos exames de ADN na medicina forense como também nos testes de paternidade e noutras respectivas áreas científicas Bibliografia: Szibor R, Krawczak M, Hering S, Edelmann J, Kuhlisch E,Krause D. Use of X-linked markers for forensic purposes[j]. Int Journal of Legal Medicine, 2003, 117(2): Hedman M, Palo J.U., Sajantila A. X-STR diversity patterns in the Finnish and the Somali population[j]. Forensic Science International, Genetics, 2009, (3): Yan L., Zhenmin Z., Yuan L., et al. The STR analysis of two congenital chimeras in paternity cases[c]. 24 th World Congress of the International Society for Forensic Genetics (ISFG), 2011: Dayse A. S., Fernanda S. N. M., Ma rcia D., et al. Paternity testing involving human remains identification and putative half sister: Usefulness of an X-hexaplex STR markers [J]. Forensic Science International: Genetics Supplement Series, 2009, (2): Dorit B., Heike R.,Christa A., et al. Population genetic evaluation of eight X-chromosomal short tandem repeat loci using Mentype Argus X-8 PCR amplification kit [J]. Forensic Science International: Genetics, 2008, 2(1): Laura C., Raquel C., Raquel C., et al. Interest of X chromosome(argus X-12 kit) in complex kinship analysis [J]. Forensic Sci. Int. Gene. Suppl., 2011, 3(1):