Extração de DNA genômico de sementes de alface (Lactuca sativa L.) para análises AFLP.

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1 Sousa, C.S.; Pereira, C.D.; Bonetti, A.M.; Goulart, L.R. e Kerr, W.R. Extração de DNA genômico de sementes de alface (Lactuca sativa L.) para análises AFLP. Horticultura Brasileira, v.20,n.2, julho Suplemento 2. Extração de DNA genômico de sementes de alface (Lactuca sativa L.) para análises AFLP. 1 Cristina S. Sousa, 2 Cícero D. Pereira, 2 Ana M. Bonetti, 2 Luiz R. Goulart e 3 Warwick E. Kerr Universidade Federal de Uberlândia - 1 Instituto de Ciências Agrárias - 2 Instituto de Genética e Bioquímica, Campus Umuarama, CEP , Uberlândia, MG; 3 Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia, Cx. Postal 478, CEP RESUMO A identificação e caracterização da diversidade genética de plantas por meio de técnicas moleculares envolvem a avaliação de vários indivíduos e demanda métodos rápidos e precisos de extração de DNA. O co-isolamento de polissacarídeos, fenóis e compostos secundários é o principal problema encontrado no isolamento e purificação de DNA vegetal. O presente estudo foi realizado com o objetivo de encontrar um protocolo que forneça quantidade e qualidade de DNA de sementes de alface suficiente para o desenvolvimento da técnica AFLP. Para isso foram testados três protocolos de extração de DNA, dos quais o de PAXTON et al., (1996), com algumas modificações, apresentou o melhor resultado. Palavras-chave: Lactuca sativa, marcador molecular. ABSTRACT Genomic DNA extraction from lettuce seeds for AFLP analysis The identification and characterization of plant genetic diversity through molecular techniques include screening of several individuals; therefore, fast and reliable methods are required for DNA extraction. The co-isolation of polysaccharides, polyphenols and secondary metabolites are the main problems for isolation and purification of plant DNA. The present study aimed the development of a simple protocol for Lettuce DNA extraction, in order to obtain enough quantity of good quality samples for AFLP analyses. After three attempt, the best protocol was PAXTON et al., (1996) protocol (modificated). Keywords: Lactuca sativa, molecular marker. A tendência geral do melhoramento genético de plantas é a integração das técnicas clássicas com os avanços da biotecnologia, levando-se em consideração as vantagens e limitações de cada uma delas. Neste contexto, a tecnologia de marcadores moleculares pode contribuir significativamente para o conhecimento básico da cultura e do caráter estudado e para a

2 geração e desenvolvimento de produtos melhorados. A técnica AFLP também conhecida por SRFA (Amplificação Seletiva de Fragmentos de Restrição), descrita por ZABEAU e VOS (1993) é uma das mais recentes e úteis para obtenção de uma grande quantidade de marcadores moleculares distribuídos em genomas de procariotos e eucariotos, sendo bastante usada para estudos de fingerprinting, mapeamento genético localizado e construção de mapa genéticos, principalmente, em espécies de plantas cultivadas que apresentam uma baixa taxa de polimorfismo de DNA. Uma das limitações dessa técnica é a exigência de um DNA com alto nível de pureza para garantir digestão completa pelas enzimas de restrição (FERREIRA & GRATTAPLAGLIA,1998). Em plantas, é comum a utilização de tecidos vegetais frescos como folhas e meristemas (apicais e radiculares) para obtenção de DNA. No entanto, nem sempre tais tecidos estão disponíveis e outros materiais, como sementes,podem ser a fonte do material genético. Este trabalho teve por objetivo otimizar um protocolo para extração de DNA de sementes de alface, para estudos de produtos amplificados por AFLP. MATERIAL E MÉTODOS Como fonte de DNA foram utilizadas sementes de cinco cultivares de alface, entre elas a cultivar Moreninha de Uberlândia que apresentava 0% de germinação. Vários protocolos de extração foram testados (PEREIRA, 2001; MCDONALD et al, 1993) e a qualidade e quantidade do DNA verificadas. A quantidade de DNA foi determinada por espectrofotometria num comprimento de onda de 260nm. A qualidade foi verificada por eletroforese em gel de agarose 1,5% (1,5 g/100ml de TBE 0,5X) assim como pela reação de AFLP, por meio da análise dos fragmentos amplificados. Independente do protocolo utilizado, as sementes foram, inicialmente, e maceradas em nitrogênio líquido e submersas imediatamente no tampão de extração característico de cada protocolo. Outro protocolo seguido foi o descrito por PAXTON et al., (1996) com algumas modificações. Vinte sementes de alface foram colocadas no cadinho e maceradas em nitrogênio líquido por 1 minuto. Em seguida adicionou-se 400 l de tampão SET (NaCl 0,15M, Tris 0,02 M, EDTA 1mM ph 8.0) mais 14,5 l de proteinase K (10mg/ml) e 18 l de SDS (25%), passando a solução para um microtubo de 2,0 ml incubando por 1 hora à 55 C. Posteriormente, adicionou-se 400 l de NaCl 5M misturando bem, em vórtex. Centrifugou-se por 10 minutos à rpm. O sobrenadante foi transferido para outro microtubo sendo adicionado 150 l de Tris (0,01M-pH 8.0), centrifugando por 10 minutos à rpm. O sobrenadante foi coletado e acrescentou-se 6 l de RNase (10mg/mL) mantendo por meia hora a 37 C. Posteriormente, o volume do tubo

3 foi completado com clorofórmio e centrifugou-se por a rpm. Coletou-se o sobrenadante e completou-se o volume com etanol 100%, deixando-se à -20 C overnight. Centrifugou-se por 20 minutos a rpm, retirando o etanol 100% e acrescentando etanol 70%. Centrifugou novamente, por 20 minutos a rpm. O etanol foi retirado, deixando secar bem em estufa. Imediatamente após, o pellet foi diluído em 200 l de TE e estocado à - 20 C. Para reações de AFLP utilizou-se o Kit AFLP TM Analysis System I (Gibco BRL) seguindo, na maioria dos passos, as instruções do fabricante. Os DNAs genômicos das alfaces foram submetidos as seguintes etapas e reações: Reação de restrição: utilizou-se 300ng de DNA, 5 l de tampão de reação, 2 µl da solução contendo as enzimas EcoRI/MseI e água destilada, completando para o volume final de 25 µl. As reações enzimáticas foram processadas a 37 C por 2h e a inativação das enzimas a 70 C por 15 minutos. Ligação dos adaptadores: Foi adicionado ao DNA digerido da etapa anterior, 24 l de solução de adaptadores e 1 l de T4 ligase. A reação de ligação dos adaptadores aos fragmentos de restrição ocorreu a 20 C por 2h. Depois da ligação dos adaptadores, fez-se a diluição da reação na proporção de 1:10 (10 l da reação e 90 de TE) para ser utilizada no pré-amplificação. Reação de pré-amplificação: Utilizou-se 20 l de mix de primer, 1U de Taq polimerase, 2,5 l de tampão com MgCL 2, 2,5 l do DNA diluído com adaptador e água. A reação de PCR consistiu de 20 ciclos:desnaturação do DNA: 94 C por 30 segundos, anelamento dos primers: 50 C por 1 minuto e extensão pela Taq polimerase: 72 C por 1 minuto. A reação de pré-amplificação foi diluída na proporção de 1:50 (3 µl de reação e 147 l de TE). Reação de amplificação AFLP seletiva: utilizou-se 5 µl de DNA pré-amplificado diluído, 5 l de um par de primer, 1U de Taq polimerase e tampão com MgCL 2. A reação de PCR foi dividida em 3 etapas. A primeira constou de 6 ciclos, onde a desnaturação ocorreu a 94 C por 30 segundos, anelamento dos primers a 65 C por 30 segundos e a extensão a 72 C por 1 minuto. A segunda etapa constou de 6 ciclos de 94 C por 30 segundos, 60 C por 30 segundos e 72 C por 1 minuto. A terceira etapa, com 23 ciclos de 94 C por 30 segundos, 56 C por 30 segundos e 72 C por 1 minuto. Para a amplificação seletiva foram utilizados primers obtidos do Kit AFLP Starter Primer Kit (GIBCO BRL). A Separação e visualização dos produtos amplificados foram feitas em gel de poliacrilamida desnaturante 8%. Foi acrescentado nas amostras metade do volume da amostra de Stop Buffer (Xyleno cyanol, azul de Bromofenol, EDTA 10Mm e formamida), sendo estas desnaturadas à 90 C por 3 minutos. A coloração foi feita com nitrato de prata e a revelação com carbonato de sódio anidro. RESULTADOS E DISCUSSÂO

4 O protocolo sugerido por MCDONALD et al.,(1993) é considerado rápido para extração de DNA de sementes de soja, milho, trigo, amendoim e trevo vermelho onde foi utilizado com sucesso em reações de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Para o desenvolvimento da técnica AFLP, este protocolo mostrou-se ineficiente, provavelmente, devido à baixa qualidade do DNA obtido. Com o protocolo descrito por PEREIRA (2001) a quantidade de DNA obtida foi muito baixa, aproximadamente, 10 ng/ l inviabilizando a reação de AFLP já que a quantidade de DNA foi otimizada para 300ng por reação. O protocolo que apresentou melhores resultados foi o de PAXTON et al., (1996) modificado, que possibilitou a extração de DNA de ótima qualidade como mostrado em gel de agarose (Figura 1). A figura 2, mostra um gel de poliacrilamida com padrão de amplificação desejável para AFLP, confirmando a ocorrência de DNA template de qualidade, o que não se observa nos outros dois protocolos utilizados. Figura-1: Gel de agarose mostrando a qualidade do DNA extraído de semente de alface pelo Protocolo de PAXTON modificado. LITERATURA CITADA Figura-2: padrão de amplificação de fragmentos de DNA por AFLP utilizando DNA extraído pelo protocolo de PAXTON modificado FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3ª ed. Brasília: EMBRAPA-CENARGEM, p.

5 MCDONALD, M. B.; ELLIOT, L. J.; SWEENEY, P. M.. DNA extraction dry seeds for RAPD analyses in varietal identification studies. Seed Sci. & Technol. v. 22, p , PEREIRA,C. D.; KERR, W. E. Divergência Genética entre Doze Genótipos de Abacaxizeiro (Ananás comosus L, Merril) estimada por Análise de Marcadores RAPD. Revista Brasileira de Fruticultura, v.23, p , PAXTON, R. J.; THORÉN, P. A.; TENGO, J.; ESTOUP,A.; PAMILO, P.. Mating structure and netsnate relatedness in a-comunal bee, Adrena jacobi (Hymenoptera: Adrenidae), using microssatelite. Molecular Ecology, v.5, p: , ZABEAU, M.; VOS P. Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA fingerprinting. European Patent Apllication EP A1, 1993.