GENÉTICA HUMANA LICENCIATURA EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

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1 GENÉTICA HUMANA LICENCIATURA EM CIÊNCIAS DA SAÚDE PROTOCOLOS LABORATORIAIS 3º Ano - 1º Semestre 2013 /

2 EXTRACÇÃO DE DNA GENÓMICO ESFREGAÇO BUCAL Citogene Buccal Kit Esfregar 10 vezes a mucosa bucal com 2 escovas Mergulhar as escovas 10 vezes em 400 µl de Cell Lysis Solution num microtubo de 1,5 ml Ter o cuidado de escorrer bem as escovas para não perder líquido Incubar durante 15 a 65 C Arrefecer a amostra Adicionar 100 µl de Protein Precipitation Solution ao lisado celular Agitar no vortex durante 20 para homogeneizar completamente Colocar a amostra em gelo durante 5 Centrifugar durante 5 a xg. O precipitado de proteínas deve apresentar-se acastanhado e consistente Transferir o sobrenadante para microtubo de 1,5 ml e adicionar 450 µl de Isopropanol e 1 µl de Glicogénio (opcional) Misturar a amostra cuidadosamente 50 vezes e manter o tubo à temperatura ambiente durante pelo menos 5 Centrifugar durante 10 a xg Desprezar o sobrenadante e secar o precipitado ao ar durante Adicionar 50 µl de DNA Hydration Solution COLHEITA DE DNA PARA PCR DIRECTO Esfregar a mucosa bucal com uma zaragatoa estéril Mergulhar em microtubo contendo 1 ml de soro fisológico estéril Centrifugar durante 5 a xg e retirar o sobrenadante Ressuspender as células em 50 µl de H 2 O 3º Ano - 1º Semestre 2013 /

3 QUANTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DO DNA A partir da solução de DNA obtida, efectuar uma diluição de 1:50 em H 2 O. Ler as absorvências em 280 e 260 nm contra um branco de H 2 O. Calcular a concentração de DNA na solução obtida utilizando a seguinte fórmula: Concentração de DNA (µg / ml) = A 260 x FD x 50 Avaliar a qualidade da solução de DNA obtida por cálculo das razões de absorvência: A 260 /A 280 A 280 A 260 FD Absorvência em 280 nm Absorvência em 260 nm Factor de diluição 50 1 U de absorvência a 260 nm corresponde a uma solução de DNA com a concentração de 50 µg/ml A 260 / A 280 1,8 2,0 Controlo da integridade do DNA por electroforese em gel de agarose 1% (50 ml) Pesar 0,5 g de agarose para matraz de 100 ml Adicionar 50 ml de TBE 1X Fundir a agarose no micro-ondas Deixar arrefecer até ± 60 C Adicionar brometo de etídio (10 mg/ml) para concentração final de 0,5 µg/ml Verter no molde e colocar o pente para a formação dos poços Após formação do gel colocá-lo na tina de electroforese e cobrir com tampão TBE 1X Aplicar a mistura da solução de DNA com tampão de deposição (10 µl + 5 µl, respectivamente) em paralelo com um marcador de MM (λ DNA x HindIII) Migrar a V durante 1-2 h Visualizar o resultado por observação no ultravioleta e fotografar o gel 3º Ano - 1º Semestre 2013 /

4 AMPLIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DO DNA POR PCR Polymerase Chain Reaction Gene alvo: Tas2R38 (receptor do gosto tipo 2, membro 38) Primers : PTC_Fw CCT TCG TTT TCT TGG TGA ATT TTT GGG ATG TAG TGA AGA GGC GG PTC_Rev AGG TTG GCT TGG TTT GCA ATC ATC Dimensão esperada do fragmento a amplificar: 221 Meio de reacção Num microtubo de 500 µl adicionar os seguintes reagentes: Concentração das soluções stock Concentração pretendida Volume para 1 amostra µl x amostras Água destilada estéril Tampão FlexiBuffern (5 X) dntp Mix (100 mm) Primer F (10 µm) Primer R (10 µm) MgCl 2 (25 mm) 1x 1,5 mm 400 nm 400 nm 1,5 mm DNA Polimerase (5 U/µL) 1 U / 25 µl DNA genómico extraído ~ 400 ng 5 de epitélio bucal Volume total , Condições da reacção de PCR Temperatura Tempo Nº de Ciclos 95ºC 7 min 1 95ºC 58ºC 30 seg 30 seg 30 72ºC 30 seg 72ºC 7 min 1 4ºC Cobrir com 30 µl de parafina líquida (opcional, depende do tipo de termociclador) Colocar os microtubos no termociclador e iniciar os ciclos de amplificação No final retirar a fase aquosa inferior para novo microtubo e controlar a reacção em gel de agarose 2% (5 µl de produto de PCR), aplicando em paralelo um marcador de MM (pbr322 xmspi ou 100 bp ladder). 3º Ano - 1º Semestre 2013 /

5 DETECÇÃO DE MUTAÇÕES/POLIMORFISMOS POR ENSAIOS DE RESTRIÇÃO PCR / RFLP Determinação de perfil genético por hidrólise com enzima de restrição HaeIII (isolada da bactéria Haemophilus aegyptius) Enzima Sequência-alvo HaeIII 5..GG CC CC GG.. 5 Concentração 10 U / µl Por amostra x tubos H 2 O µl µl Tampão (10x) µl (1x) µl HaeIII (10 U/µL) µl (8 U) µl Produto de PCR 20 µl µl Volume Final 25 µl µl Incubar, no mínimo, 2h a 37ºC. Parar a reacção por adição de 5 µl de solução de deposição (Nota: contém EDTA). Analisar o produto da hidrólise em gel de agarose a 3%. 3º Ano - 1º Semestre 2013 /

6 ANÁLISE DE SEQUÊNCIAS DE DNA POR SSCP Single Strand Conformation Polymorphism Gel de poliacrilamida 8% (2 geis 15 ml) Acrilamida / bisacrilamida (37,5:1) 2,9 ml TBE 10X 1,4 ml EDTA 0,5M ph8,0 56 µl Glicerol 700 µl Água Milli Q 9,0 ml Persulfato amónio 10% 100 µl TEMED 10 µl Preparação da amostra 15 µl produto PCR + 22 µl mix EDTA/SDS/LB Bleu Homogeneizar Desnaturar a 95 C durante 5 min Colocar em gelo durante 5 min Aplicar 15 µl no gel LB Bleu Formamida 19 ml Azul bromofenol 10 mg Xileno cianol 10 mg EDTA 0,5M ph8,0 800 µl EDTA/SDS 10X SDS 20% 500 µl EDTA 0,5M ph8,0 2 ml LB Bleu /EDTA/SDS 20 µl LB Bleu + 2 µl EDTA/SDS 10X Electroforese Migração a 150 V durante 1-2 horas 3º Ano - 1º Semestre 2013 /

7 Coloração com nitrato de prata (DNA Silver Staining kit GE Healthcare) Colocar o gel em tina e cobrir com solução de fixação 1X durante 10. Retirar Adicionar solução de coloração 1X e deixar 15 em contacto ao abrigo da luz, agitando de vez em quando. Retirar Lavar com água Milli Q durante 1. Retirar Adicionar solução revelação 1X. Agitar suavemente até aparecimento das bandas Parar a reacção por adição de solução de paragem e preservação 1X e deixar actuar durante 15 Colocar o gel entre folhas de papel celofane e secar no secador de géis Solução de fixação 5X Ácido benzeno-sulfónico 3,0% (p/v) em etanol 24% (v/v) Solução de coloração 5X Nitrato prata 1,0% (p/v) Ácido benzeno-sulfónico 0,35% (p/v) Solução de carbonato sódio 5X Carbonato sódio 12,5% (p/v) Formaldeído 37% Formaldeído 37% (p/v) em água Tiossulfato de sódio 2% Tiossulfato sódio 2% (p/v) em água Solução de revelação 1X Carbonato sódio 5X 25 ml Tiossulfato sódio 2% 125 µl Formaldeído 37% 500 µl Água 100 ml Solução de paragem e preservação 5X Ácido acético 5% (v/v) Acetato sódio 25% (p/v) Glicerol 50% (v/v) 3º Ano - 1º Semestre 2013 /

8 PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS DE PCR EasySpin PCR Purification Kit Princípio O Kit EasySpin utiliza uma membrana de gel de sílica a qual adsorve seletivamente fragmentos de DNA mediante a utilização de tampões de ligação especialmente concebidos para esse efeito. Nucleótidos, oligonucleótidos, enzimas, óleo mineral e outras impurezas não aderem à membrana. Transferir o produto de PCR para um microtubo de 1,5 ml e adicionar 3 volumes de Binding Buffer I Transferir esta mistura para a coluna EasySpin e incubar 2 minutos à temperatura ambiente. Centrifugar a rpm durante 2 minutos Remover o líquido obtido pela centrifugação no tubo. Adicionar 500 µl de Wash Solution à coluna e centrifugar a rpm durante 2 minutos Repetir o procedimento de lavagem do ponto anterior. Centrifugar um minuto extra a rpm a fim de remover todos os vestígios de solução de lavagem Transferir a coluna para um novo microtubo de 1.5 ml e adicionar µl de Elution Buffer. Incubar durante 2 minutos à temperatura ambiente. Centrifugar durante 2 minutos ( rpm). Guardar o DNA purificado a -20ºC Nota: É muito importante adicionar o Elution Buffer na parte central da coluna. A incubação da coluna a temperaturas mais elevadas (37 50ºC) poderá aumentar o rendimento do DNA purificado. Aquecimento prévio do Elution Buffer (55ºC 80ºC) poderá também aumentar a eficiência do procedimento 3º Ano - 1º Semestre 2013 /

9 REGISTO DA SENSIBILIDADE GUSTATIVA À FENILTIOCARBAMIDA (PTC) Com um cotonete limpo embeber nas diferentes soluções e registar com os símbolos 0, +, ++ ou +++, de modo a identificar facilmente a sua sensibilidade gustativa. Entre cada solução lavar a boca com água Soluçãoà A B C D E F G H I J Taster / nontaster Nome e nº 3º Ano - 1º Semestre 2013 /

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