Licenciatura em Ciências da Saúde

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1 Licenciatura em Ciências da Saúde Genética Humana: aulas laboratoriais 3º Ano 1º Semestre

2 Organização e Segurança Grupos de dois alunos Bata, luvas, caderno de laboratório Caneta, lápis, marcador de acetato

3 Plano das aulas laboratoriais Três blocos: Determinação do fenótipo e genótipo de uma Hemoglobinopatia (drepanocitose) Sensibilidade gustativa à feniltiocarbamida - determinação do fenótipo e do genótipo Citogenética/Bioinformática (HSM)

4 Avaliação laboratorial Caderno de laboratório 60% Relatórios, um por bloco de aulas, 30% Assiduidade 10%

5 Caderno de Laboratório O caderno tem que estar identificado e é rubricado pelo docente todas as aulas e tem tudo: Uma breve introdução teórica do trabalho, Os protocolos Os cálculos Os resultados A discussão dos resultados Conclusões Escrito a tinta com esquemas a lápis, índice, páginas numeradas.

6 1º Trabalho Laboratorial (3 aulas) CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DA DREPANITOSE (Anemia Falciforme) 1. Electroforese de hemoglobinas 2. Extracção de DNA genómico a parfr de sangue total e sua caracterização a. QuanFficação e avaliação do grau de pureza por espectrofotometria de UV b. Avaliação da integridade por electroforese em gel de agarose 3. Detecção da mutação p.e6v por PCR- RFLP a. Amplificação por PCR da região genómica de interesse b. Hidrólise do produto de PCR com enzimas de restrição c. Avaliação dos resultados por electroforese em gel de agarose 4. Interpretação dos resultados

7 Hemoglobinas - Hb São metaloproteínas (Fe) presentes nos eritrócitos e responsáveis pelo transporte de oxigénio dos pulmões para os tecidos e de cerca de 10% de dióxido de carbono no senfdo oposto

8 A molécula de Hb é um heterotetrâmero composto por 2 cadeias α e 2 cadeias β Os principais Fpos de Hb são: F presente no feto e no recém- nascido A presente em crianças e adultos normais S, C, D, E, M e muitas outras formas alteradas

9 HemoglobinopaFas patologias causadas por alteração na estrutura ou expressão da Hb As duas patologias mais frequentes são: Drepanocitose alteração qualitafva, alteração na estrutura Talassémias alterações quanftafvas, diminuição ou ausência de síntese de uma das cadeias de globina

10 DREPANOCITOSE A Drepanocitose é causada por uma mutação específica (GAG GTG ou p.e6v) no gene HBB que codifica para a β- globina, originando a hemoglobina S (HbS) A HbS apresenta uma alteração da carga superficial (carga negafva do glutamato subsftuída pelo grupo não- polar da valina) a qual é responsável pelo fenófpo clínico

11 Consequências? Alteração morfológica do eritrócito, ficando com uma forma de foice.

12 DREPANOCITOSE Doença genéfca hereditária de transmissão autossómica recessiva. Cromossoma 11: a A sua prevalência é explicada pelo efeito de vantagem do heterozigoto, o qual não manifesta a doença mas apresenta resistência à malária.

13 O diagnósfco de drepanocitose pode ser feito através de uma electroforese de Hb ou pela pela caracterização molecular do gene HBB A mutação GAG GTG ou p.e6v é detectada pela enzima de restrição Bsu36I que reconhece a sequência 5 CC^TNA GG-3! 3 GG ANT^CC-5!

14 ELECTROFORESE DE PROTEÍNAS Ião ou grupo com carga eléctrica efecfva, quando exposto a um campo eléctrico, migra para o cátodo (- ) ou para o ânodo (+), dependendo da sua carga; Proteínas apresentam carga a qualquer valor de ph diferente do seu ponto iso- eléctrico Æ migram quando sujeitas a uma diferença de potencial Æ velocidade de migração depende da densidade de carga (razão carga / massa) da proteína; quanto maior for esta razão, maior será a velocidade de migração da molécula;

15 ELECTROFORESE DE PROTEÍNAS Migração de uma proteína num gel durante a electroforese Æ Dimensão+ Forma; Desde que um campo eléctrico seja removido antes que as moléculas da amostra cheguem aos eléctrodos, os componentes terão sido separados segundo a sua mobilidade electroforéfca. A electroforese é então uma forma incompleta de electrólise.

16 Electroforese - Matrizes Tipo I Æ papel, acetato de celulose, sílica gel, celulose Materiais inertes que servem essencialmente de suporte; Separação das proteínas processa- se através da densidade de carga a determinado ph. Actualmente pouco usados (excepto acetato de celulose)

17 Electroforese - Matrizes Tipo II Æ agarose, amido e poliacrilamida Gel - primeiro usado foi o gel de amido Meios porosos Æ dimensão do poro é da mesma ordem de grandeza das moléculas proteicas Æ separação baseia- se na densidade de carga e no tamanho molecular Æ influenciam a velocidade de migração; Poros do gel de agarose Æ suficientemente grandes Æ separação baseia- se na densidade de carga Poros dos géis de amido e de poliacrilamida Æ mesma ordem de grandeza das moléculas proteicas Æ interferem na migração

18 1 - ELECTROFORESE DE HEMOGLOBINAS Fundamento do método A separação eletroforéfca das hemoglobinas baseia- se nas caracterísfcas eléctricas das moléculas de globina, que podem estar carregadas negafva ou posifvamente (dependendo do ph do meio), apresentando, assim, diferentes mobilidades quando submefdas a um campo eléctrico. Tina de electroforese Tira de acetato de celulose Fonte de alimentação

19 ELECTROFORESE DE HEMOGLOBINAS EM ACETATO DE CELULOSE E ph ALCALINO A ph alcalino (tampão Tris- glicina ph=9,5) as Hb apresentam uma carga global negafva pelo que migrarão do cátodo para o ânodo e 5 Controlos 2 Adulto normal 3 Recém- nascido 4 Drepanocitose homozigófca 6 e 8 Drepanocitose heterozigófca 7 Heterozigoto SC

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21 Extracção de DNA de sangue total DNA existe em quase todas as células No sangue humano os eritrócitos não são nucleados Como eliminar os eritrócitos, mantendo os glóbulos brancos intactos? Lise com água Centrifugando o lisado, os gb vão para o fundo do tubo e as proteínas dos gv ficam em solução.

22 Extracção de DNA - 1 As células são lisadas recorrendo a detergentes, dodecil dulfato de sódio (SDS), na presença de agentes quelantes, EDTA e proteases, proteinase K. Os detergentes solubilizam as membranas O EDTA sequestra os iões divalentes (Mn 2+, Mg 2+ ) necessários a muitas nucleases A proteinase K digere as proteinas

23 Extracção de DNA 2 Há várias formas de separar as proteínas do DNA, cromatografia, extracção com solventes Salting out : utilização de uma solução salina saturada, 6M de NaCl faz precipitar as proteínas mantendo o DNA em solução Precipitação do DNA com álcool etílico ou isopropílico. Lavar com EtOh a 70% e dissolver no tampão final (TE, ph 7,5)

24 Segurança Usar sempre luvas para trabalhar com sangue Leia o protocolo antes de começar Tenha a bancada sempre arrumada Não ajude o colega nas manipulações Não sabe ou tem dúvidas? Pergunte!

25 Utilização de Micropipetas

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