PRÁTICA: ANÁLISES CLÍNICAS - COLESTEROL TOTAL E COLESTEROL HDL PARTE A - DOSAGEM BIOQUÍMICA DE COLESTEROL TOTAL (CT)

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1 CENTRO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DISCIPLINA BIOQUÍMICA Profas. Roziana Jordão e Alexandra Salgueiro PRÁTICA: ANÁLISES CLÍNICAS - COLESTEROL TOTAL E COLESTEROL HDL I Objetivos Determinar colesterol total (CT) e colesterol HDL em amostras; Interpretar resultados. PARTE A - DOSAGEM BIOQUÍMICA DE COLESTEROL TOTAL (CT) II A Introdução O colesterol total é determinado bioquimicamente de acordo com as seguintes reações enzimáticas: ésteres de colesterol + H 2 O COLESTEROL ESTERASE colesterol + ácidos graxos colesterol + O COLESTEROL OXIDASE 2 colestenona + H 2 O 2 2 H 2 O 2 + Fenol + 4 aminoantipirina PEROXIDASE antipirilquinonimina + 4 H 2 O Os ésteres de colesterol são hidrolisados pela enzima colesterol esterase, produzindo colesterol livre e ácidos graxos. O colesterol livre é oxidado pela enzima colesterol oxidase com formação de colestenona e peróxido de hidrogênio. Na presença de peróxido de hidrogênio, o fenol e a 4-aminoantipirina são oxidados por ação da peroxidase, formando antipirilquinonimina. Essa reação é estável por 60 minutos e a intensidade da cor avermelhada formada é diretamente proporcional à concentração do colesterol total na amostra. III -A Procedimento 1. Marcar os tubos de ensaio e adicionar os volumes conforme o quadro abaixo: Sistema Tubos B (branco) P (padrão) A (amostra) Amostra (teste) µl Padrão (200 mg/dl) - 10 µl - Reagente enzimático 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml Observações: (i) Trabalhar em duplicatas para minimizar erros nas determinações analíticas. (ii) O reagente de cor (enzimático) contém as enzimas envolvidas na determinação analítica (especificadas nas reações), além dos compostos 4-aminoantipirina, fenol e tampão.

2 2. Homogeneizar e colocar em banho-maria a 37 C durante 10 min. O nível de água do banho deve ser superior ao nível de reagentes nos tubos de ensaio. 3. Determinar as absorbâncias do teste e do padrão em 500 nm ou em filtro verde (490 a 510 nm), utilizando o tubo controle (branco). Cálculo CT (mg/dl) = Absorbância do teste x 200 Absorbância do padrão PARTE B - SEPARAÇÃO E DOSAGEM DE COLESTEROL HDL (HDL-C) II - B Introdução A técnica utilizada é composta de duas etapas: precipitação seletiva e dosagem. Precipitação seletiva As lipoproteínas de baixa densidade que contém Apo B, entre elas a LDL (Low Density Lipoprotein) e VLDL (Very Low Density Lipoprotein) são precipitadas na presença de um poliânion e de um cátion divalente (geralmente Mg ++ ). O sobrenadante obtido após centrifugação do soro precipitado é utilizado para determinação do colesterol correspondente à fração ligada ao HDL, denominada de colesterol-hdl ou HDL-C, lipoproteína de alta densidade. Dosagem pelo método enzimático A dosagem do HDL-C é realizada de acordo com as reações para colesterol total, exceto para a solução padrão respectiva que tem a concentração de 20 mg/dl. III B Procedimentos 1. Precipitação seletiva (i) Em um tubo de centrífuga, adicionar 0,25 ml de amostra e 0,25 ml do precipitante; (ii) agitar vigorosamente durante 30 s; (iii) centrifugar a rpm por 15 min, para obter um sobrenadante límpido; (iv) pipetar o sobrenadante imediatamente após a centrifugação, cuidadosamente, para não ressuspender o precipitado. 2. Dosagem (i) Em tubos de ensaio, adicionar os volumes de acordo com o quadro a seguir: Sistema Tubos B (branco) P (padrão) A (amostra) Amostra µl Padrão (20 mg/dl) - 10 µl - Reagente enzimático 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml Observação: Para minimizar erros nas determinações analíticas, trabalhar em duplicatas. (ii) homogeneizar as soluções dos tubos e levar ao banho-maria a 37 C por 10 min; (iii) ler absorbâncias em espectrofotômetro em 500 nm ou filtro verde (490 a 540 nm) e ajustar o zero com o tubo branco.

3 Cálculo Absorbância da amostra x (colesterol-hdl em mg/dl) Absorbância do padrão 20 mg/dl Observação: O resultado deve ser multiplicado por 2 pois a amostra foi diluída de 1:2 com o precipitante no início da técnica. HDL-C (mg/dl) = Absorbância da amostra Absorbância do padrão x 40 HDL-C (mg/dl) = Fator x absorbância da amostra Fator = 40 Absorbância do padrão O perfil lipídico é definido pelas determinações de CT, HDL-C, TG e, quando possível, de LDL-C após jejum de 12 a 14 h. A metodologia para determinação do LDL-C aplica a Fórmula de Friedewald, abaixo especificada: LDL-C = CT - (HDL-C + VLDL-C) VLDL-C = TG / 5 Onde: LDL-C = Colesterol-LDL; CT = Colesterol Total; VLDL-C = Colesterol-VLDL A fórmula é limitada pela concentração de TG; só é aplicável se a mesma for inferior a 400 mg/dl. IV Interpretação de resultados Os valores de referência de lipídeos para indivíduos acima de 20 anos de idade estão especificados na Tabela 1.

4 Tabela 1 Valores de referência de CT, LDL-C e HDL-C para indivíduos maiores de 20 anos de idade Lipídeo Valores Categoria (mg/dl) CT < 200 ótimo limítrofe 240 alto LDL-C < 100 ótimo desejável limítrofe alto 190 muito alto HDL-C < 40 baixo normal > 60 alto Atualmente, vários lipídeos são mensurados no sangue: colesterol total, lipoproteína de alta densidade (HDL-C), lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) e triglicerídeos. Os níveis de LDL caminham paralelos com os níveis de colesterol total. Dieta rica em gorduras, tabagismo e sedentarismo são as maiores causas de elevação das taxas de colesterol, além do fator genético. Pessoas que têm familiares com altas taxas de colesterol, mesmo com hábitos de vida saudáveis, apresentam maior probabilidade de possuírem taxas elevadas desse lipídeo. Alguns fatores podem alterar a dosagem do colesterol; determinadas doenças: hipotireoidismo, diabetes mal controlada e insuficiência renal podem elevar os níveis de colesterol além da utilização de alguns medicamentos. Na avaliação do risco para Doença Arterial Coronariana (DAC), os valores de HDL-C devem ser interpretados em conjunto com os outros dados do perfil lipídico. HDL-C é considerado um fator anti-aterogênico. Há boa correlação estatística entre altos níveis de HDL-C e diminuição do risco de Doença Arterial Coronariana e Infarto Agudo do Miocárdio (DAC/IAM). É também chamado de "bom" colesterol pelo fato de que altos níveis do mesmo, estarem relacionados com risco diminuído para desenvolvimento da aterosclerose. Os valores de HDL-C tendem a aumentar com a prática de atividade física e perda de peso. O LDL-C é um importante parâmetro do perfil lipídico para avaliação do risco de DAC/IAM; é chamado fator aterogênico, pois seu aumento no soro está fortemente associado a um aumento no risco dessas patologias; é conhecido como "mau" colesterol. V Referências LABTEST Diagnóstica Colesterol Total (COD ANA). Cat. 60-2/100. Instruções de uso. Minas Gerais: Labtest Diagnóstica; rev. nov, LABTEST Diagnóstica Colesterol HDL (COD ANA). Cat. 13. Instruções de uso. Minas Gerais: Labtest Diagnóstica; rev. maio, 1999.

5 CENTRO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DISCIPLINA BIOQUÍMICA Profas. Roziana Jordão e Alexandra Salgueiro Aluno: Turma: Data: FIXAÇÃO DO APRENDIZADO DA PRÁTICA ANÁLISES CLÍNICAS - COLESTEROL TOTAL E COLESTEROL HDL 1 Que fatores podem interferir nas dosagens de colesterol? 2 Calcule as concentrações de CT, HDL-C e LDL-C na amostra investigada. 3 Interprete os resultados de CT, HDL-C e LDL-C detectados. 4 Avaliando o perfil lipídico determinado, que fatores de riscos apresenta o paciente referente à amostra investigada? Especifique algumas recomendações.

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