Detecção de IL-1 por ELISA sanduíche. Andréa Calado

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1 Detecção de IL-1 por ELISA sanduíche Andréa Calado

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7 ELISA O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas; PRINCIPAIS TIPOS: INDIRETO: Detecta principalmente Ac SANDUÍCHE: Detecta principalmente Ag COMPETIÇÃO: Detecta Ag com baixo peso molecular (monovalentes) CAPTURA: Detecção de Acs (principalmente IgM, evitando a ação do fator reumatóide).

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9 Avidia + peroxidase Amostra contendo Ag Ac conjungado com biotina Substrato

10 Kit ELISA IL-1 Placa 96 poços revestido com Ac Padrão liofilizado + diluente Reagente de detecção A + diluente Reagente de detecção B + diluente Substrato TMB Tampão de lavagem Solução Stop

11 A placa do kit foi pré-revestido com um anticorpo monoclonal específico para IL1; Amostras são então adicionados aos poços; Depois o anticorpo policlonal conjugado com biotina, anticorpo específico para a preparação IL1; Em seguida, avidina conjugada com peroxidase (HRP) é adicionado a cada microplaca e incubadas. Pra finalizar, uma solução de substrato TMB é adicionada a cada poço.

12 Apenas os poços que contêm IL1, anticorpo conjugado com biotina e avidina conjugado com enzima irá apresentar uma mudança de cor. A reação enzima-substrato é terminada pela adição de uma solução de ácido sulfúrico e a mudança de cor é medida espectrofotometricamente a um comprimento de onda de 450 nm ± 10 nm. A concentração de IL1 nas amostras é em seguida, determinada por comparação do OD das amostras para a curva padrão.

13 Materiais necessários Leitor Pipetas de precisão Ponteiras descartáveis Eppendorf para amostras de diluição água destilada Papel absorvente Recipiente para solução de lavagem

14 Preparação das amostras Reconstituir a solução padrão com 1mL do diluente e agitar suavemente; A concentração dessa solução é 1000pg/mL. Colocar 0,5mL de diluente nos 8 tubos.

15 Procedimento Preparar sete poços para o padrão e um para o branco. Adicionar 100µL de cada solução padrão, do branco e das amostras nos poços. Cubrir com o vedante de placa. Incubar durante 2 horas a 37oC.

16 Preparação das amostras Preparar o diluente A e B: 6mL do diluente (2x) com 6mL de agua destilada: Solução de diluição A: 12mL Solução de diluição B: 12mL Preparar os reagente A e B na diluição 1: Reagente A 1:100 Sol. Diluição A (diluente + agua)

17 Solução de lavagem: 20mL da solução de lavagem + 580mL de água destilada

18 Procedimento Preparar sete poços para o padrão e um para o branco. Adicionar 100µL de cada solução padrão, do branco e das amostras nos poços. Cubrir com o vedante de placa. Incubar durante 2 horas a 37oC. Retirar o líquido de cada poço, não lavar. Adicionar 100µL da solução de detecção A em cada poço e incubar durante 1 hora a 37oC depois de cobrir com o vedante de placa

19 Procedimento Aspirar e lavar com 350µL com solução de lavagem; Adicionar 100µL da solução de detecção B em cada poço. Incubar durante 30 minutos a 37oC e depois cobrir com o vedante de placa. Repetir a aspiração e lavagem Adicionar 90μL de Substrato e Incubar por minutos a 37oC. Adicionar 50μL de solução de paragem em cada poço. O líquido ficará amarelo com a adição de solução de paragem. Em seguida, execute o leitor de microplacas e medição a 450 nm imediatamente

20 Observações Adicionar cuidadosamente amostras aos poços e misturar suavemente para evitar a formação de espuma. O tempo total para a adição de distribuição de reagentes ou amostras para a placa de ensaio não deve exceder 10 minutos. Para evitar a contaminação cruzada, mudar as ponteiras entre as adições de cada nível padrão, entre as adições de amostra e de reagente

21 Observações O tempo de incubação e a temperatura devem ser observados. O procedimento de lavagem é crítico. A remoção completa do líquido em cada passo é essencial para a boa desempenho. Após a última lavagem, remover qualquer solução de lavagem remanescente, remover qualquer gota de água e de impressões digitais na parte inferior da placa. Lavagem insuficiente resultará em má precisão e leitura de absorbância falsamente elevado

22 Cálculo dos resultados Média das leituras em duplicata para cada padrão, controle e amostras; Criar uma curva padrão em log, gráfico com concentração IL1 sobre o eixo y e absorbância no eixo x. Desenhar a melhor reta através dos pontos padrão e pode ser determinada por análise de regressão. Se as amostras foi diluída, a concentração lida a partir da curva padrão deve ser multiplicada pelo fator de diluição.

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24 Sensibilidade e especificidade SENSIBILIDADE A dose mínima detectável de IL1 canino é menor do que 7.3pg/mL ESPECIFICIDADE Este ensaio tem uma alta sensibilidade e especificidade excelentes para a detecção de IL1 canino. Não significativa reatividade cruzada ou interferência entre IL1 caninos e análogos foi observada. Nota: Limitada por habilidades e conhecimentos atuais, é impossível para nós completar a detecção de reatividade cruzada entre IL1 canino e todos os análogos, portanto, reação cruzada, podem ainda existir

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