Protocolos das Aulas Laboratoriais de. Bioquímica e Biologia Molecular

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1 Protocolos das Aulas Laboratoriais de Bioquímica e Biologia Molecular 2º Semestre, 2014/2015 Arsénio Fialho Leonilde Moreira Jorge H. Leitão Nuno Mira Miguel Teixeira Isabel Sá-Correia Instituto Superior Técnico

2 Protocolos das Aulas Laboratoriais de Bioquímica e Biologia Molecular TP1. Titulação potenciométrica de aminoácidos. TP2.- Determinação da concentração de proteína pelo Método de Bradford. Análise de proteínas por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) TP3. Caracterização cinética da enzima invertase determinação dos parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten TP4. Laboratórios Virtuais Bioquímica/Biologia Celular TP5. Extracção rápida e em pequena escala do DNA cromossómico e plasmídeo da bactéria Escherichia coli TP6. Digestão do DNA cromossómico e plasmídico com uma enzima de restrição. Separação e visualização dos fragmentos de restrição por electroforese em gel de agarose

3 TP1. TITULAÇÃO POTENCIOMÉTRICA DE AMINOÁCIDOS. Os 20 α-aminoácidos fundamentais constituem-se como as unidades que compõem as proteínas. Cada um dos aminoácidos, ligado a um átomo de carbono central (alfa), contém um grupo amina, -NH 2, um grupo carboxilo, -COOH, um átomo de hidrogénio e um grupo R, variável entre os 20 aminoácidos. De um modo geral, em sistemas biológicos, o valor de ph do meio é próximo da neutralidade (ph 7). Deste modo, um dado aminoácido apresentará o grupo amina protonado e o grupo carboxilo desprotonado. Esta configuração representa a designada forma zwitteriónica para o aminoácido. Em soluções fortemente ácidas o grupo carboxilo apresentar-se-à protonado, enquanto que em soluções de elevado caracter básico (alcalinas) ambos, grupo carboxilo e grupo amina apresentarse-ão na forma desprotonada. Solução ácida Solução básica Deste modo verifica-se que um dado aminoácido (que não contenha um grupo adicional ácido ou básico no seu grupo R), apresenta propriedades ácido-base, comportando-se como um ácido diprótico. A sua titulação com uma base (p. ex. NaOH) dá origem a uma curva com dois patamares, resultado das reacções abaixo indicadas:

4 A figura abaixo indicada representa a curva de titulação de um aminoácido (assumindo que o mesmo não possui um grupo ionizável no seu grupo R). Para tal, avalia-se a variação do valor de ph de uma solução do aminoácido em função da adição de equivalente de OH - (adição de uma base forte). Na curva identificam-se dois patamares (estabilização do valor de ph para adição de equivalentes OH - ), separados por uma região em que se verifica um aumento exponencial do valor de ph. Os vários pontos destacados ao longo da curva, bem como o seu significado, estão de seguida indicados: Neste caso existirão dois pk a determinar, o pka 1 e o pka 2, correspondentes à ionização do grupo COOH e do grupo NH + 3, respectivamente. No gráfico acima estes valores de pk estão representados pelos pontos B e D. O ponto B pode ser tido como o ponto de equivalência da curva de titulação entre os pontos A e C (pontos finais da titulação onde existem 100% de cada

5 uma das formas em equilíbrio). Analogamente o ponto D pode ser tido como o ponto de equivalência da titulação entre os pontos C e E. Se tomarmos a equação de Handerson- Hasselbach, ph = pka + log([base]/[ácido]) e admitindo a condição de ponto de equivalência (onde a concentração de ácido é igual à concentração de base), então o valor de cada pka é igual ao valor do ph do meio quando a curva atinge o ponto B ou o D (aproximadamente 2 e 10, neste caso). A determinação do ponto de equivalência da curva de titulação pode ser feita de diversas formas sendo a utilização do método da derivada uma boa opção. Por definição o ponto de equivalência representa um ponto de inflexão da curva de titulação e, portanto, um ponto onde a primeira derivada atinge um valor máximo. Na figura abaixo encontra-se representada a curva de titulação do grupo NH3 + de um aminoácido sem o grupo R ionizável (losangos) em conjunto com a função derivada desta curva (quadrados). Como se pode observar, o máximo da derivada coincide com o ponto de equivalência da curva de titulação.

6 Procedimento experimental: Neste trabalho laboratorial proceder-se-á à titulação potenciométrica dos aminoácidos alanina e ácido glutâmico. Reagentes e material: Solução NaOH 2M Solução de alanina 0,1 M (acertada a ph 1.8 com HCl) Solução de ácido glutâmico 0,1 M (acertada a ph 1.8 com HCl) Medidor de ph 1. Calibre o medidor de ph com as soluções tampão apropriadas. 2. Colocar 30 ml da solução 0,1 M de alanina num copo de vidro. 3. Ler e registar o ph da solução de alanina (V titulante = 0 ml; o ph deve rondar 1.8-2). 4. Titular a solução de alanina com a solução a 2M de NaOH, adicionando as gotas lentamente (0,1 ml em 0,1 ml). Mantenha a solução em permanente agitação usando uma barra de agitação magnética. Para cada volume de titulante adicionado registe o valor de ph. Considere a titulação terminada quando o ph atingir o valor de Repita o mesmo procedimento usando agora a solução de ácido glutâmico disponível. Resultados e Discussão 1. Represente a curva de titulação da alanina e do ácido glutâmico. 2. Estime o valor de pka1 e pka2 com base no método da derivada (se necessitar pode estimar o valor do ph ao volume equivalente usando uma interpolação linear entre os valores dos seus dados). 3. Escreva a estrutura da alanina e do ácido glutâmico ao longo da curva de titulação indicando todos os pontos onde ocorrem modificações na carga do aminoácido. 4. Indique as regiões onde considera que existe poder tampão dos dois aminoácidos 6. Estime o ponto isoeléctrico da alanina e compare com valores tabelados. Material complementar:

7 TP2 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE UMA PROTEÍNA PELO MÉTODO DE BRADFORD. ANÁLISE DE PROTEÍNAS POR ELECTROFORESE EM GEL DE SDS-POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE) Introdução As proteínas constituem uma vasta classe de biomoléculas que desempenham na célula funções muito diversas. Para analisar simultaneamente um tão grande e variado grupo de compostos, é necessário recorrer a técnicas que utilizem uma propriedade comum a todos esses compostos, mas que simultaneamente evidenciem pequenas variações no seu comportamento, de modo a que as várias moléculas sejam diferenciadas. As técnicas de electroforese caem nesta categoria, e são largamente utilizadas pois baseiam-se no facto de todas as proteínas apresentarem uma carga eléctrica global quando colocadas num meio de ph diferente do seu ponto isoeléctrico. Deste modo é possivel provocar a migração de proteínas sugeitando-as a um campo electrico. Essa migração variará de acordo com a proteína, uma vez que é influenciada pelo tamanho, carga, forma e composição química de cada molécula. Grosseiramente, pode-se considerar que a migração electroforética duma molécula é apenas função da sua densidade de carga, ou seja, da respectiva razão carga/massa. Assim as proteínas separar-se-ão de acordo com o respectivo valor desta razão: quanto maior ela for, maior será a velocidade de migração da molécula. A electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) é um método rápido e sensível para analisar a composição de misturas proteicas complexas. A PAGE utiliza um suporte em que os monómeros de acrilamida, ao polimerizarem, formam longas cadeias, as quais se ligam entre si por crosslinking ( ligações cruzadas ), através dos resíduos de bis-acrilamida, também nelasincorporados. O processo de polimerização consiste numa reacção em cadeia de radicais livres, iniciada pelo persulfato de amónio (PSA) e pelo N,N,N,N -tetrametilinediamina (TEMED), os quais se encontram presentes na mistura de polimerização. O PSA activa o TEMED, deixando-o com um electrão desemparelhado. Este radical reage então com uma molécula de acrilamida, transformando-a também num radical. Este, por sua vez, reage com um

8 outro monómero de acrilamida (ou, ocasionalmente, com a bis-acrilamida), dando origem a novo radical, e assim sucessivamente até se formar um polímero com ligações cruzadas (crosslinked). O número de ligações cruzadas (quantidade de crosslinking), controla o tamanho dos poros do gel e consequentemente determina o intervalo de massa molecular das proteínas que podem ser separadas nesse gel. Isto quer dizer que, consoante o número de ligações cruzadas, assim se separam as proteínas com baixa massa molecular ou com elevada massa molecular. O conteúdo total de acrilamida de um gel pode variar entre 3 e 30%, correspondendo o valor da percentagem ao total das moléculas de acrilamida (i.e. acrilamida e bis-acrilamida, p/v). A separação de uma mistura de proteínas no sistema SDS-PAGE é pois um reflexo da diferença dos respectivos tamanhos. A massa molecular da(s) proteína(s) em questão pode ser estimada por comparação da respectiva mobilidade electroforética (R f ), com a de proteínas de massa molecular conhecida (padrões) (Ver figura na página seguinte) A simplicidade e rapidez desta técnica, adicionadas ao facto de que apenas é necessária uma pequena quantidade de amostra (alguns microgramas), tornam a electroforese em gel de poliacrilamida no método mais utilizado para a análise de misturas proteicas complexas. Uma vez que as proteínas de praticamente todas as origens são facilmente solubilizadas pelo SDS, a técnica possui aplicação generalizada. As proteínas separadas no gel de poliacrilamida podem ser facilmente coradas com uma solução contendo azul de Coomassie. Este composto permite visualizar quantidades de proteína da ordem de 0,1 µg. Apesar deste método permitir detectar praticamente todos os constituintes da maior parte das amostras proteicas, surgem por vezes situações em que é necessária uma maior sensibilidade, a qual pode ser alcançada recorrendo-se ao método de coloração com nitrato de prata. O método de Bradford é um dos vários procedimentos utilizados para determinar a concentração de proteína total numa dada amostra. Este método colorimétrico baseia-se na formação de complexo entre o reagente de Coomassie e as proteínas (máximo de absorção aos 595 nm). A concentração da proteína na amostra é determinada com base numa recta de calibração obtida com uma solução padrão de proteína (no caso albumina sérica bovina).

9 MARCADOR DE PESO MOLECULAR LMW (BioRad) 97,0; 66,0; 45,0; 30,0; 20,1; 14,4 kda POÇOS PARA APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS ESQUEMA DE UM GEL DE POLIACRILAMIDA (AS PROTEÍNAS MIGRARÃO DE CIMA PARA BAIXO) PROTEÍNAS PADRÃO 2 mistura complexa contendo proteínas com vários pesos moleculares devidamente separadas 3 proteína pura GEL CORADO COM AZUL DE COOMASSIE (as proteínas são visíveis nas diferentes pistas)

10 Procedimento experimental Neste trabalho vai proceder-se à determinação da concentração de uma amostra das proteínas albumina, ovalbumina e catalase usando o método de Bradford. Essas mesmas amostras serão posteriormente sujeitas a uma electroforese SDS-PAGE tendo em vista a determinação do peso molecular da albumina, ovalbumina e catalase. A- Determinação da concentração de proteína pelo Método de Bradford Preparação da recta de calibração: 1. A determinação da concentração de proteína vai ser feita com recurso a uma recta de calibração preparada a partir de soluções de proteína com concentração conhecida. Para isso comece por preparar as soluções-padrão de BSA usando a solução mãe de 1 mg/ml. Siga as indicações da tabela abaixo: [BSA](µg/ml) V pipetar sol. stock BSA mg/ml VH 2 O (µl) Em tubos de ensaio de vidro adicione 2,5 ml de reagente de Coomassie a 5 µl de cada solução de albumina sérica que preparou. 3. Agite vigorosamente no vórtex e aguarde 15 minutos. 4. Proceda à leitura das absorvâncias das soluções a 595nm. Construa a recta de calibração com base nas concentrações das soluções de albumina sérica bovina e nos respectivos valores de A 595nm medidos.

11 Determinação da concentração de proteína nas amostras: 1. Em tubos de ensaio de vidro adicionar 2,5 ml de reagente de Coomassie a 5 µl da solução de proteína que pretende quantificar (Efectue o ensaio em duplicado). 2. Agitar vigorosamente no vórtex e espere 15 min. 3. Proceder à leitura da absorvância (595nm) das soluções preparadas em Com base na recta de calibração que determinou no ponto anterior, calcule a concentração de proteína na solução. Separação electroforética de proteínas por SDS-PAGE Montagem do sistema de SDS-PAGE 1. Preparar o sistema para fazer o gel. 2. Preparar o gel de resolução (12,5% de acrilamida), juntando: -1,25 ml de solução I (Tabela II) -2,08 ml de solução de acrilamida -1,64 ml de água destilada -8 µl de TEMED -33 µl de persulfato de amónio 10% Misturar cuidadosamente e pipetar imediatamente a solução entre as placas de vidro e silica até uma altura de aproximadamente 6 cm. Colocar uma camada de 1 ml de isopropanol de forma a obter uma superfície plana. Deixar polimerizar. 3. Após polimerização remover o isopropanol com papel absorvente. 4. Preparar o gel de concentração (6% de acrilamida) juntando: -0,4 ml de solução II (Tabela II) -0,4 ml de solução de acrilamida -1,2 ml de água destilada

12 -4 µl de TEMED -12 µl de persulfato de amónia 10% Misturar cuidadosamente, encher as placas com esta solução e colocar o pente. Deixar polimerizar. 5. Montar o sistema de electroforese e preencher os tanques com tampão de electroforese 1x (Tabela II) Preparação e aplicação das amostras no gel. 7. Prepare as amostras para aplicação no gel juntando 5 µl da solução de proteína com 5 µl de tampão da amostra. Ferver durante 2 min. 8. Junte 20 µl da mistura complexa de proteínas a 5 µl do tampão de amostra. Ferva durante 2 minutos. 9. Com a ajuda de uma pipeta automática, aplique as amostras e padrões no gel que foi já previamente preparado. (Não se esqueça de anotar a ordem de aplicação das amostras e padrões). 10. Coloque a solução de electroforese (já diluída) nas tinas superior e inferior do aparelho de electroforese. 11. Coloque a tampa da camara de electroforese, fazendo a conexão dos eléctrodos. 12. Ligue os electrodos à fonte de electroforese, tendo em atenção à respectiva polaridade. (Por convenção, o vermelho é o positivo e o preto é o negativo). As proteínas irão migrar para o polo positivo. 13. Coloque o botão que regula a voltagem no máximo, de forma a esta não ser limitante. 14. Regule o botão da intensidade de corrente para um valor correspondente a 20mA por gel. 15. Deixe que a migração do azul de bromofenol atinja o fim do gel de resolução. 16. Desligue a fonte de energia, desligue os electrodos, remova a tampa da câmara, despeje a solução de electroforese, e remova a sanduiche retirando as respectivas molas. Com o auxílio de um espaçador (ou de qualquer outro objecto de plástico), separe as duas placas (a de vidro e a de alumina).

13 Colorir as proteínas no gel 1. Coloque cuidadosamente o gel numa caixa contendo solução corante com azul de Coomassie. 2. Deixe a corar durante 15-20min. 3. Retire o gel para outra caixa contendo água destilada. Escorra a água e lave novamente com água destilada. 4. Escorra a água e adicione solução descorante. Agite durante 5-10min. 5. Repita o ponto anterior até observar nítidamente as bandas correspondendo às várias proteínas. Coloque o gel sobre um pedaço de papel de filtro grosso (3MM), cubra com Larfilm e seque no secador de geis. Resultados e Discussão Com base na recta de calibração feita com as soluções padrão de BSA calcule a concentração de proteína das soluções de albumina, ovalbulmina e catalase usadas; Calcule a massa de proteína aplicada no gel; Determine o peso molecular das proteínas ovalbumina, catalase e albumina com base nos seus valores de Rf, usando para o efeito a recta de calibração feita com a amostra de proteínas padrão Compare os valores de peso molecular obtidos experimentalmente com os valores expectáveis discutindo as vantagens e limitações da técnica de SDS-PAGE.

14 Tabela II- Soluções usadas para a electroforese de proteínas em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes. SOLUÇÃO REAGENTES OBSERVAÇÕES Tampão do gel de resolução (I) 1.5 M Tris base ph 8,8-9,0 0,4% SDS Tampão do gel de concentração 0,5 M Tris base ph 6,6-6,8 (II) 0,4% SDS Solução de acrilamida (bisacrilamida) 30% acrilamida 0,8% bisacrilamida Tampão de electroforese Tris- Glicina 10x 0,25 M Tris base 1,92 M glicina ph 6,6-6,8 Diluir 1:10 antes de usar 1% SDS Tampão de aplicação em SDS- PAGE 20% glicerol 4% SDS 100 mm Tris.Cl ph 6,8 0,2% azul de bromofenol 200 mm DTT Solução corante 2 g Coomassie blue R ml ácido acético 475 ml etanol 425 lm água Solução descorante 80 ml ácido acético 210 ml etanol 510 ml água

15 TP3 CARACTERIZAÇÃO CINÉTICA DA ENZIMA INVERTASE - DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS DE MICHAELIS- MENTEN A enzima invertase (beta-fructofuranosidase; EC ) catalisa a hidrólise da sacarose nos seus dois monómeros constituintes: glucose e frutose. Existem actualmente várias aplicações industriais desta enzima, sobretudo na indústria alimentar, onde a enzima usada tem origem na levedura. No presente trabalho experimental irá proceder-se à caracterização cinética da enzima, para o que se estudará o efeito da concentração do substrato (sacarose) na actividade da enzima. Estudar-se-á ainda o efeito da alteração da temperatura de reacção nos parâmetros cinéticos. Parte experimental Executar o seguinte ensaio para cada uma das soluções de sacarose 1. Medir 25ml de solução de sacarose para o reactor, e termostatizá-la a 30ºC ou 40ºC com agitação (basta esperar cerca de 5 minutos). Executar os ensaios por ordem crescente de concentração da sacarose. 2. Preparar o número de tubos de ensaio requeridos para cada ensaio, marcando os tubos e colocando em cada 0,5ml do reagente de DNS. 3. Retirar uma amostra de 0,5ml do reactor, correspondente ao tempo zero, para um tubo de ensaio já preparado. 4. Adicionar ao reactor 0,5ml da solução de invertase, marcando simultaneamente o início da contagem do tempo. 5. Retirar amostras de 0,5ml do reactor de minuto a minuto até se completarem 7 minutos de reacção. As amostras devem ser colocadas imediatamente nos tubos de ensaio que já contêm reagente de DNS, garantindo que todo e qualquer elemento de volume da amostra se mistura

16 com o reagente (para paragem da reacção enzimática, devido ao simultâneo aumento do valor de ph da solução). Cobrir os tubos que contêm amostra com uma tampa solta. 6. Preparar um tubo de ensaio com solução tampão e reagente de DNS, nas mesmas quantidades e proporções que as dos tubos que contêm as amostras, a que se chamará de branco. Colocar-lhe também uma tampa. 7. Após a colheita e preparação das 8 amostras e do branco, referentes ao estudo cinético, colocar os respectivos tubos no banho de água a 100ºC durante 5 minutos (para que se dê a reacção com o DNS). 8. Ao fim dos 5 minutos os tubos devem ser arrefecidos em água fria. 9. Adicionar 5ml de água destilada a cada tubo arrefecido. Agitar cada tubo no vórtice. 10. Ler a absorvência de cada solução a λ=540nm, contra o branco de tampão acetato ph 4.5 que sofreu o mesmo tratamento. Soluções fornecidas: - Soluções de substrato (sacarose) a 5, 10, 15, 25, 50 e 100 g/l. Estas soluções estão preparadas em tampão acetato 20mM ph 4,5, contendo 1% (p/v) de cloreto de cálcio. - Solução enzimática de invertase (0,10mg/ml) [grau-v, da Sigma-Aldrich Co.], em tampão acetato a ph 4,5. Recta de calibração (DNS) 1. A partir de uma solução de 1,0 g/l de glucose em tampão acetato 20mM ph 4,5, efectuar diluições para 0,8 g/l; 0,6 g/l; 0,4 g/l e 0,2 g/l de glucose no mesmo tampão (preparar 2ml de cada diluição). 2. Aplicar o método do DNS [1] a estas 5 soluções padrão e traçar a recta de calibração obtida. O método consiste na execução do protocolo acima indicado substituindo as amostras pelas soluções de glucose.

17 Atenção: A recta de calibração pode também ser construída com soluções de qualquer outro açúcar redutor ou com misturas destes, pois o produto que é detectado a λ=540nm resulta da reacção com qualquer açúcar redutor. Tratamento dos resultados 1.- Determinar as velocidades iniciais de reacção para cada concentração inicial de sacarose, [expressas em moles de substrato hidrolisado / (volume reaccional tempo)], para o sistema ensaiado a 30ºC e a 40ºC. 2.- Calcular as constantes cinéticas, para cada uma das temperaturas reaccionais, através da representação gráfica de Lineweaver-Burk. Sugestão de consulta bibliográfica [1] Miller, G.L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Analytical Chemistry, 31: [2] Bahar, T. e Tuncel, A. (2004). Concanavalin A carrying reactive beads for yeast invertase purification, Reactive & Functional Polymers, 61:

18 TP5 - EXTRACÇÃO DO DNA CROMOSSÓMICO DE ESCHERICHIA COLI. EXTRACÇÃO RÁPIDA E EM PEQUENA ESCALA DE DNA PLASMÍDICO (MÉTODO DA LISE ALCALINA). Os cromossomas de procariotas são geralmente moléculas circulares covalentemente fechadas, embora em alguns casos se tenham observado cromossomas lineares. O tamanho de um cromossoma bacteriano varia entre algumas centenas de kb (1 kb = 1000 pares de base) (7,8 x 10 5 para Mycoplasma pneumoniae) e aproximadamente kb (9,5 x 10 6 para Myxococcus xanthus), contendo cada célula apenas uma cópia. O cromossoma bacteriano contém genes essenciais para as diversas funções celulares e ainda genes específicos da espécie. Devido à inexistência de membranas celulares internas em bactérias, o DNA cromossómico encontra-se agregado numa região citoplasmática à qual se denominou nucleoide. Para além do cromossoma, as células bacterianas apresentam ainda outros elementos genéticos tais como plasmídeos, transposões, elementos de inserção e vírus. Plasmídeos de ocorrência natural apresentam uma variação de tamanho entre 1 kb e algumas centenas de kb. Possuem replicação autónoma e a maioría deles são circulares, embora algumas espécies bacterianas apresentem plasmídeos lineares. Os plasmídeos contêm genes essenciais para a sua manutenção na célula (iniciação e controlo da replicação) e ainda genes que em determinados ambientes, conferem vantagem selectiva ao hospedeiro. Assim, os plasmídeos podem ter genes que conferem resistência a antibióticos, responsáveis por processos de virulência, toxinas, produção de antibióticos, sistemas de modificação/restrição, vias metabólicas degradativas, indução de tumores em plantas ou a fixação de azoto. Pode-se afirmar que os plasmídeos de ocorrência natural são os responsáveis pela grande variedade fisiológica em bactérias. A partir destes elementos genéticos naturais, é possível por manipulação genética, construir no laboratório vectores de clonagem, os quais são depois utilizados como veículos para clonagem de genes. Estes elementos genéticos, contém de um modo geral, entre outros, um local de clonagem com diferentes locais únicos para determinadas enzimas de restrição, um ou mais genes que codificam para enzimas que conferem resistência a antibióticos e regiões promotoras.

19 Neste trabalho laboratorial pretende-se extraír o cromossoma (trabalho 5A) e dois plasmídeos/vectores de clonagem (pwh844 e pugdg) (trabalho 5B) da estirpe Escherichia coli HB101 e sua posterior restrição (trabalho 6A) e visualização após separação dos fragmentos de DNA em gel de agarose (trabalho 6B) onde será estimado o peso molecular aproximado desses plasmídeos. 5A- Extracção do DNA cromossómico da estirpe Escherichia coli HB101 Procedimento experimental Diagrama para a preparação de DNA cromossómico 1 ml centrifugar Adicionar Ressuspender 250 µl sedimento em solução lisozima 250 µl 20% sacarose E. coli HB101 Vortex 15 min a 37ºC Adicionar Transferir vortex Adicionar Adicionar 30 min 37ºC Adicionar 100 µl igual volume fase superior 70 µl acetato pronase clorofórmio novo tubo centrifugar 300 µl de sódio 10 min fenol/clorofórmio Centrifugar Transferir Adicionar 700 µl centrifugar Lavar sedimento fase superior isopropanol a -20ºC novo tubo 5 min 70 % EtOH Secar a 60 o C 10 min

20 Guardar 4 o ressuspender em 100 µl TE 1. Inocular a estirpe E. coli HB101 em 50 ml de meio LB (composição em anexo) e inocular durante a noite a 37 C com agitação. 2. Pipetar 1 ml para um tubo de microcentrífuga e centrifugar 3 minutos a rpm. Remover completamente o sobrenadante e adicionar 250 µl de uma solução 20% de sacarose em tampão TE. Ressuspender por vortex. 3. Adicionar 250 µl de uma solução de lisozima (5 mg/ml em tampão TE) e misturar cuidadosamente. Incubar 15 minutos a 37 C. 4. Adicionar 100 µl de pronase E (5 mg/ml em 10% N-lauroilsarcosine) e misturar. Incubar 30 min a 37 C. 5. Adicionar 70 µl de acetato de sódio 3 M (ph 5.3) e misturar. 6. Adicionar seguidamente 300 µl de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1). Misturar e centrifugar 10 min. Recolher a fase aquosa (superior) novo tubo. Repetir o passo À fase aquosa recolhida, adicionar 300 µl de clorofórmio/álcool isoamílico. Misturar e centrifugar. 8. Transferir a fase aquosa (superior) para um novo tubo e precipitar o DNA cromossómico por adição de 700 µl de isopropanol (mantido a -20 C) e misturar até aparecimento do DNA. Centrifugar 5 min e remover o sobrenadante. 9. Lavar o sedimento de DNA cromossómico com 500 µl de etanol a 70%. Centrifugar durante 5 min, remover o sobrenadante e secar o DNA a 60 C durante 10 minutos. 10. Ressuspender o sedimento de DNA cromossómico em 100 µl de tampão TE (10 mm Tris.Cl ph 8.0; 1 mm EDTA). Conservar a 4 C até posterior utilização.

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22 5B- Extracção do DNA plasmídico da estirpe Escherichia coli HB101 recorrendo à técnica da lise alcalina Existem vários métodos de extracção de DNA plasmídico. O método utilizado neste trabalho consiste numa modificação do método de Birmboin & Doly (1979). O processo inicia-se pelo crescimento das células até início da fase estacionária. Segue-se a recolha do sedimento de células por centrifugação e a sua ressuspensão numa solução contendo glucose e lisozima e adição de uma solução de hidróxido de sódio e SDS (dodecil sulfato de sódio). Este tratamento provoca a lise celular, dissolução da membrana plasmática, desnaturação de macromoléculas (proteínas e DNA) e hidrólise do RNA. Adiciona-se então uma solução de acetato de potássio (KAc) 3M (ph=4,5) que promove a precipitação do complexo SDSproteínas. O ph ácido da solução KAc permite ainda neutralizar o ph do lisado, fortemente alcalino devido à presença de NaOH. Este reequilíbrio do ph leva à renaturação do DNA plasmídico, restabelecendo a sua conformação original. Contudo, o DNA cromossómico, devido às suas dimensões, não consegue voltar à sua forma nativa, permanecendo sob a forma de agregados complexos. Após a adição do KAc, é pois possível, por centrifugação, separar um sedimento constituído por membranas, proteínas e DNA cromossómico de um sobrenadante onde o DNA plasmídico se encontra dissolvido. Uma desproteinização mais profunda desse sobrenadante é posteriormente levada a cabo utilizando uma mistura de fenolclorfórmio de modo a obter DNA plasmídico suficientemente puro e assim adequado a servir de substrato para as enzimas de restrição. Por fim, o DNA plasmídico é precipitado com etanol, seco, e ressuspenso em tampão TE. Birnboin, H.C., & Doly, J A rapid alkaline extraction procedure for screening recombunant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7:

23 Procedimento experimental Diagrama para a preparação de DNA plasmídico (método da lise alcalina) 1 ml centrifugar 5 min Adicionar Ressuspender 200 µl Sedimento em em gelo solução II 200 µl solução I E. coli HB101/pWH844 Vortex E. coli HB101/pUgdG 10 min Temp amb Adicionar Transferir vortex Adicionar Transferir 10 min gelo Adicionar 200 µl igual volume fase superior sobrenadante solução III clorofórmio novo tubo centrifugar igual volume novo tubo Centrifugar fenol/clorofórmio Centrifugar Transferir Adicionar colocar 10 min centrifugar Lavar sedimento fase superior 70 % EtOH novo tubo 500µl EtOH no gelo Secar a 60 o C 5 min Guardar 4 o C ressuspender em 50 µl TE 1. Inocular as estirpes E.coli HB101 contendo os plasmídeos pwh844 e pugdg, em 50 ml de meio LB (composição em anexo) e incubar durante a noite a 37 o C com agitação. 2. Pipetar 1 ml para um tubo e centrifugar 3 minutos a rpm, 4 ºC. Remover completamente o sobrenadante e adicionar 200 µl de solução I (50 mm glucose, 10 mm EDTA, 25 mm Tris.Cl ph 8; 10 mg/ml lisozima) e ressuspender. Incubar 5 min em gelo.

24 3. Adicionar 200 µl de solução II (0,2 M NaOH; 1% SDS). Misturar suavemente por inversão do tubo e colocá-lo durante 10 min à temperatura ambiente. 4. Adicionar 200 µl de solução III (3 M acetato de potássio ph 4,5 ajustado com ácido acético glacial). Misturar por inversão do tubo e colocá-lo durante 10 min em gelo. 5. Centrifugar o lisado durante 15 min a rpm, 4oC. Transferir o sobrenadante para novo tubo e adicionar um volume igual de fenol/ clorofórmio/ alcool isoamílico (25: 24: 1). Vortex e centrifugar durante 5 min. 6. Transferir a fase aquosa (superior) para um novo tubo e adicional um volume igual de clorofórmio: alcool isoamílico (24:1). Vortex e centrifugar durante 5 min. 7. Transferir a fase superior aquosa para um novo tubo. Precipitar o DNA plasmídico por adição de 500 µl etanol absoluto colocado a -20oC. Deixar 10 min no gelo. Centrifugar 10 min e remover o sobrenadante. 8. Lavar o sedimento de DNA plasmídico com 500 µl de etanol a 70%. 9. Separar o precipitado por centrifugação (15000 rpm, 5 min), remover o sobrenadante e secar o DNA plasmídico a 60ºC durante 5 min. 10. Ressuspender o sedimento de DNA em 25 µl de tampão TE (10mM Tris.Cl, ph8; 1 mm EDTA). Conservar à temperatura de 4ºC até posterior utilização.

25 TP6 DIGESTÃO DO DNA CROMOSSÓMICO E PLASMÍDICO COM UMA ENDONUCLEASE DE RESTRIÇÃO; SEPARAÇÃO E VISUALIZAÇÃO DE FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO POR ELECTROFORESE EM GEL DE AGAROSE 6 A- Restrição do DNA cromossómico e dos plasmídeos pwh844 e pugdg de E. coli HB101 por acção de uma endonuclease de restrição Endonucleases são enzimas que reconhecem sequências específicas de bases no DNA e são capazes de hidrolisar as cadeias de DNA. Uma vez que essa hidrólise ocorre em ambas as cadeias, os sistemas de reparação celular não funcionam, permitindo dessa forma a destruição de ácidos nucleicos invasores (ex: virus). Para além da sua função protectora na célula, as enzimas de restrição têm também extrema importância em investigação científica, nomeadamente em processos de clonagem de genes, execução de mapas de restrição ou a determinação do tamanho de moléculas de DNA. Procedimento experimental plasmídeos DNA cromossómico pwh844/pugdg DNA 17 µl 17 µl Tampão do enzima 1x 2 µl 2 µl Enzima de restrição EcoRI 1 µl 1 µl

26 1. Adicionar em cada tubo de microcentrífuga os volumes indicados na tabela anterior, com a seguinte ordem: DNA (plasmídico ou cromossómico), tampão da enzima 1x, água e finalmente a enzima de restrição. 2. Misturar cuidadosamente e incubar a 37ºC durante 1h. 3. Guardar a -20ºC até posterior utilização. 6B- Visualização do DNA cromossómico e plasmídico por electroforese em gel de agarose Electroforese é uma técnica onde moléculas com carga são capazes de migrar por aplicação de um campo eléctrico, sendo a sua separação efectuada com base no peso molecular. A separação de ácidos nucleicos que se encontram carregados negativamente (grupos fosfato) é efectuada geralmente em géis de agarose. A agarose forma uma matriz porosa (cujo tamanho do poro pode ser controlado) e através do qual as moléculas de ácidos nucleicos migram a uma velocidade principalmente dependente da massa (pb) e conformação das moléculas. A velocidade de migração depende ainda da sua composição nucleotídica, da concentração da matriz de agarose utilizada, do campo eléctrico aplicado ao sistema (V/cm) e ainda da composição do tampão utilizado na electroforese. Após migração dos ácidos-nucleicos em gel de agarose, é possível visualizar estas moléculas, imergindo o gel numa solução de brometo de etídeo, pois este composto intercala-se nas suas cadeias e é fluorescente quando irradiado com radiação ultravioleta, permitindo desta forma à sua detecção. Procedimento Experimental Dissolver deixar verter numa solidificar colocar gel adicionar 0,8 g agarose forma com na tina TAE 1x por arrefecer pente electroforética TAE 1x

27 fervura Colocar 1 a 2 h mergulhar 15 min visualização amostras gel gel solução plasmídeos fotografar 100 V TAE com GelRed com luz UV DNA plasmídico com ou sem restrição + 2 µl corante DNA cromossómico com ou sem restrição + 2 µl corante 1 µl padrão DNA + 2 µl corante 1. Preparar um gel de agarose com concentração de 0,8% em tampão TAE (1x) (composição deste tampão em anexo). Após suspensão da agarose no tampão, ferver até obter uma mistura homogénea. Arrefecer ate 50º C antes deitar a mistura líquida dentro do molde contendo um pente de 8 dentes de modo a formar 8 câmaras com a possibilidade de aplicação de 25 µl da solução de DNA. Deixar solidificar o gel durante ~ 30 min. 2. Remover cuidadosamente o pente e colocar o gel (ainda sobre o molde) na tina horizontal de electroforese e encher a unidade com tampão TAE (1x) até que o nível do tampão cubra e ultrapasse em 1 mm a superfície do gel. 3. Aplicar em cada uma das câmaras presentes no gel, as amostras de DNA cromossómico e plasmídico, onde se adicinou previamente 2 µl de uma solução corante com elevada densidade (40% sacarose; 0,25% azul de bromofenol; 0,25% xilenocianol). Como referência aplicar também uma amostra contendo uma mistura de fragmentos de peso molecular conhecido (1 kb DNA ladder) (ver anexo). 4. Iniciar a electroforese por aplicação de um campo eléctrico (100 V) (não esquecer que os ácidos nucleicos migram para o ânodo).

28 5. Após separação electroforética, colocar o gel numa solução de Gel Red preparada em tampão TAE 1 x, durante 15 min. 6. Retirar o gel do tampão anterior usando luvas (o brometo de etídeo é cancerígeno) e remover o líquido em excesso. 7. Visualizar o DNA plasmídico pela fluorescência emitida pelo brometo de etídeo a estes associado, quando irradiado com radiação UV. 8. Fotografar o gel sob radiação ultravioleta.

29 ANEXO Meio LB (g/l) - 10 g Peptona - 5 g Extracto de levedura - 5 g NaCl Tampão TAE (50x) (TP6) -242 g TRIS base -57,1 ml ácidi acético glacial -100 ml de solução de EDTA 0,5 M (ph 8.0) -H 2 O até 1 litro Ajustar o ph a 8,0. Padrão de pesos moleculares (TP6) NZYDNA ladder III Plasmídeo vector de clonagem pwh844

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