Extração de DNA e Amplificação por PCR

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1 Universidade Federal de São Carlos Departamento de Genética e Evolução Disciplina Práticas de Genética Extração de DNA e Amplificação por PCR Érique de Castro , Victor Martyn , Wilson Lau Júnior Introdução A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica de Biologia Molecular que permite a replicação in vitro do DNA, de forma extremamente rápida. Com a PCR, sequências mínimas do material genético podem ser amplificadas milhões de vezes em poucas horas, permitindo a detecção rápida e viável dos marcadores genéticos de doenças infecciosas, doenças genéticas, e outras muitas utilidades. A PCR trabalha com o princípio natural de replicação do DNA. Consistindo em um processo de três passos básicos, que se repete em ciclos inúmeras vezes. Assim, um ciclo de PCR consiste nas seguintes etapas: Desnaturação com calor; Hibridização ou Annealing : hibridiza-se nas extremidades das sequência alvo primers (um em cada simples fitas produzida); Extensão: a adição da Taq polimerase na solução faz com que esta enzima inicie o processo de síntese da nova dupla fita, na região do primer, incorporando os nucleotídeos complementares. Alguns componentes são essenciais para que ocorra a PCR: Presença de uma DNA polimerase termoestável, como por exemplo, Taq (Termus aquaticus) a ou Tfl (T. flavus); Presença de um par de primers, oligonucleotídeos que funcionam como ponto de início da polimerização; Cátions divalentes, como MgCl2; Deoxinucleotídeos trifosfatados (dntps), com quantidades iguais de datp, dctp, dttp e dgtp; DNA molde, podendo ser fita simples ou fita dupla; Tampão para manutenção do ph, geralmente entre 8,3 e 9 à temperatura ambiente. O resultado da PCR é observado através da eletroforese. A eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, pois as de menor massa irão migrar mais rapidamente que as de maior massa. A eletroforese normalmente é utilizada para separar proteínas e moléculas de DNA e RNA. 1

2 Objetivo O objetivo desta prática consiste em demonstrar os processos e métodos de extração de DNA, assim como a amplificação por PCR usando diferentes primers, e a observação do resultado através da eletroforese. Materiais e Métodos 1. Extração do DNA por Tiocianato de guanidina Antes da extração em si, é necessário a preparação de um tampão para a lise celular e um uma solução para a precipitação proteica. O tampão foi preparado com as seguintes substâncias e concentrações: 100 mm NaCl 100 mm Tris-HCl ph mm EDTA ph % SDS Enquanto que para a preparação da solução de precipitação proteica foi usado: 4M Tiocianato de guanidina 0.1M Tris-HCl ph 7.5 Com os procedimentos acima realizados pode-se então iniciar a extração do DNA, para isso o primeiro passo é realizar a lise celular e o tratamento com RNAse. Colocou-se 10 mg de tecido com 300 μl de cell lysis buffer e 1.5 μl de proteinase K (20 mg/ml), o tecido (no caso uma mosca Anastrepha) foi macerada, seguida de uma incubação de 1h, a 57 C. Homogenizando ocasionalmente. Após a espera de 1h o preparado foi levado à centrífuga por 1min a 4 000rpm para precipitar algum material não digerido e o sobrenadante foi transferido para um tubo novo contendo 1.5 μl de RNAse A (4 mg/ml). Homogenizando bem e incubado a 37 C por 30 min. O intuito é, além de conseguir extrair o DNA, não permitir que enzimas DNAses degradem o material, eliminar as histonas que estão auxiliando no enovelamento da amostra, 2

3 eliminar ácidos nucleicos não necessários (RNA) e deixar o conteúdo mais purificado possível (apenas as moléculas de DNA). Segundo passo é a precipitação das proteínas, os métodos utilizados foram: Adicionar 100 μl de protein precipitation solution, em seguida homogenizar no vórtex por no máximo 5s. Após isso centrifugar a rpm por 5 min. O sobrenadante é transferido para um tubo novo. O terceiro passo é a precipitação e lavagem do DNA: 2/3 de volume de clorofórmio é adicionado no tubo, homogenizado por inversão durante 1 min e centrifugado a rpm por 1 min para separar a fase orgânica da aquosa. A fase aquosa é transferida para um tubo novo. Foi adicionada 300 μl de isopropanol 100% e misturado por inversão 50 x. E novamente é centrifuado a rpm por 5 min. O sobrenadante é descartado por inversão do tubo. 300 μl de etanol 70% é adicionado e o tubo é invertido gentilmente 3x. Logo há uma nova centrifugação a rpm por 5 min. O sobrenadante é descartado por inversão. Após todo esse processo os tubos são deixados secando à temperatura ambiente. O quarto passo é a ressuspensão do DNA e estocagem: É adicionado de 50 a 200 μl de água e por fim deixar à temperatura ambiente por 1h, homogeneizando a cada 15 min. Alíquotas de trabaho são separadas e levados ao estoque a - 20 C. Para longa duração o estoque é feito a -80 C. O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel. 2. Amplificação por PCR Os quatro grupos extraíram o DNA de um indivíduo e preparam uma solução com um primer diferente, e cada grupo utilizou o DNA extraído por todos os outros grupos. Então, no total, cada grupo fez 6 tubos de reação: quatros com cada DNA extraído, um com o controle positivo e um branco (sem amostra nenhuma). As reações realizadas foram: 3

4 Reação 1: O Grupo 1 fez a Reação 1, essa primeira reação usou os reagentes abaixo e o DNA anteriormente extraído para preparação de uma soluções. Reagentes μl Água 33.6 Tampão 10 x 7.0 MgCl 2 (15 mm) 7.0 dntps (2 mm cada) Primer dsx A56f (2 μm) Primer dsx 1016r (2 μm) CapeTaq (5U/μL) 1.4 DNA - Em seguida foram realizados os seguintes passos: 1. Aplicar 9 μl da solução mãe em microtubos: 200 ul. 2. Aplicar 1 μl de amostras de DNA. 3. Incubar a reação em termociclador (Ivory) seguindo o protocolo abaixo: 94 C 1 min 94 C 30 s 47 C 30 s 72 C 45s Goto 2 35 x 72 C 10 min 4 C infinito O Grupo 2, usou a mesma metodologia do grupo 1 para realizar a Reação 2, entretanto não foi usado o primer dsx A56f (2 μm) e sim o primer dsc T56f (2 μm). 4

5 Reação 3: O Grupo 3 fez a Reação 3, sendo que essa reação utilizou os componentes abaixo e o DNA anteriormente extraído para preparação das soluções: Reagentes μl Água 33.6 Tampão 10 x 7.0 MgCl 2 (15 mm) 7.0 dntps (2 mm cada) 7.0 Primer dsx A100f (2 μm) 7.0 Primer dsx 1016r (2 μm) 7.0 CapeTaq (5U/μL) 1.4 DNA - Em seguida foram realizados os seguintes passos: 1. Aplicar 9 μl da solução mãe em tubos de 200 μl. 2. Aplicar 1 μl de amostras de DNA. 3. Incubar a reação em termociclador seguindo o protocolo abaixo: 94 C 1 min 94 C 30 s 57 C 30 s 72 C 45s Goto 2 35 x 72 C 10 min 4 C infinito O Grupo 4 realizou a Reação 4, utilizando o método da Reação 3, mas além de usar o Primer dsx A100f (2 μm) utilizou o Primer dsx C100f (2 μm). 5

6 Resultados Figura 1 Eletroforese. 1 - Grupo Grupo Grupo Grupo 4. Em branco - controle negativo. M - Controle positivo. 1. Extração de DNA Os grupos conseguiram extrair o material genético É imprescindível que a extração seja precisa, já que há DNAses dentro das células que podem degradar o material genético caso algo seja feito incorretamente. A qualidade da extração é vista a partir da eletroforese, já que boas amostras formam bandas fortes (Ex: G1), amostras que não formam banda houve algum tipo de erro no processo(ex: G4). 2. Amplificação de DNA por PCR Após a realização da PCR são geradas grandes amostras de DNA, produtos de diferentes comprimentos, e estes produtos são analisados por transiluminação UV em gel de agarose, ou seja, através da eletroforese. O menor dos produtos migra ma is rápido e gera a banda mais abaixo no gel. Em geral o gel de agarose separa bem fragmentos entre 150 pb e 1000 pb. Fora desta faixa pode ser necessário usar um gel de poliacrilamida. 3. Eletroforese em gel de agarose 6

7 No procedimento feito em sala, apenas o controle positivo apresento u bandas em todas as amostras utilizando os diferentes primers. O primer A56 teve a banda mais visível nos três primeiros grupos, o quarto grupo deve ter perdido material genético durante o processo, já que banda nenhuma é visível, em nenhum dos primers. Discussão As bandas formadas que apresentaram cor forte no gel possuem grandes quantidades do material analisado, já que o intuito da PCR é justamente produzir em larga escala o fragmento de DNA desejado. Bandas inexistentes ou muito fracas são fruto da perda do material, durante o processo de extração ou erro na PCR, logo, torna-se inconclusiva parte da análise. A banda do primer A56 foi o único com o qual a molécula de DNA hibridizou, logo apenas aquele fragmento foi polimerizado. No par de bases de número 56 a presença de Adenina na fita onde o primer se hibridiza o fez com que todo o fragmento con dizente fosse replicado inúmeras vezes. Se a molécula apresentasse bandas relacionadas aos outros primers, o DNA destes conteria as bases nos respectivos locais (T57: Timina no par 57 na fita onde o primer se hibridiza seria replicado). Conclusão O primer e a fita devem apresentar complementação para que, estes, se hibridizem e possam ser polimerizados. O primer A57 além de possuir a Adenina na posição 57, possuía complementação com a fita, mesmo se na fita complementar apresentasse Adenina na posição 57 não haveria a hibridização de todos os nucleotídeos (como funcionaria numa banda que o primer T57 polimerizasse), por isso ocorreu a polimerização em cadeia especificamente da fita correspondente ao fragmento observado na banda. 7

8 Referências Bibliográficas WATSON, JD. Biologia molecular do gene. 5ª. ed. Porto Alegre, Artmed, MALECINSKI, GM. Fundamentos de Biologia Molecular. 4ª. ed. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, Sites: (Acesso 05 Nov 2012) (Acesso 06 Nov 2012) 8

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