FACUAL. Estrutura genética da população de Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides no Estado do Mato Grosso RELATÓRIO TÉCNICO

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1 FACUAL Estrutura genética da população de Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides no Estado do Mato Grosso RELATÓRIO TÉCNICO Coordenador: Nelson Dias Suassuna Fitopatologista - Embrapa Algodão Campina Grande Novembro de 2003

2 Instituição Executora: - Fundaper Fundação de Amparo à Pesquisa, Assistência Técnica e Extensão Rural do Estado de Mato Grosso - Embrapa Algodão Campina Grande - Paraíba Relatório parcial: Novembro de 2003 Coordenador do Projeto: Nelson Dias Suassuna 1. Atividades realizadas: 1.1. Plano de amostragem Utilizou-se um plano de amostragem hierárquico, visando obter amostras de modo a quantificar a variabilidade de Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides entre e dentro populações. Em cada local amostrado procurou-se identificar a planta foco (geralmente a planta com sintomas mais acentuados, no centro da reboleira), e a partir desta, foram coletadas quatro amostras, uma em cada ponto cardeal, além de uma amostra em cada planta vizinha. Inicialmente fora proposto realizar-se coletas em cinco municípios (Rondonópolis, Primavera do Leste, Sapezal, Campo Novo do Parecis e Sorriso), coletando-se dez amostras por município. Todavia, além dos municípios propostos inicialmente, foram amostradas áreas nos municípios de Campo Verde, Lucas do Rio Verde, Alto Taquari, Pedra Preta e Itiquira. Nosso objetivo de se coletar amostras no município de Porto Alegre do Norte não foi efetivado por não se localizar áreas com epidemias de ramulose nesta safra. Os municípios de Campo Novo do Parecis e Sorriso foram excluídos por conta de já haverem sido obtidas amostras em municípios vizinhos (Sapezal e Lucas de Rio Verde, respectivamente). Em cada um dos oito municípios, foram amostradas quatro áreas e obtidas seis amostras por área, totalizando 192 amostras. As amostras consistiram de folhas lesionadas em plantas apresentando superbrotamento. Cada ponto amostrado foi georeferenciado utilizando-se GPS (sistema de posicionamento global). As amostras foram herbarizadas, identificadas e enviadas ao Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Algodão (amostras de Sapezal e Lucas do Rio Verde) e ao Laboratório de Epidemiologia da Universidade Federal de Viçosa (Amostras de Rondonópolis, Pedra Preta, Itiquira, Alto Taquari, Primavera do Leste e Campo Verde). As amostras oriundas de Alto Taquari, não foram georeferenciadas por falta de bateria no aparelho de GPS na ocasião da coleta. 1

3 1. 2. Isolamento e cultivo in vitro De cada amostra, procedeu-se isolamento indireto. Fragmentos de tecidos lesionados foram lavados por 30 segundos em hipoclorito de sódio a 1,5 %, em seguida lavados em água destilada esterilizada (ADE), imersos por mais 30 segundos em álcool 70% e outra vez lavados em ADE. Os fragmentos foram então depositados em placas de Petri contendo meio BDA (Batata, Dextrose e Ágar) acidificado com ácido lático (1%). As placas foram mantidas em incubadora com temperatura ajustada para 28ºC e 12 horas de luz. Do segundo ao quinto dia após a incubação, colônias apresentando crescimento e morfologia típica de C. gossypii var. cephalosporioides foram repicadas para novas placas contendo meio BDA. De todas as colônias repicadas foram confeccionadas lâminas para posterior confirmação da identidade do patógeno Preservação dos isolados A partir de culturas puras, foram efetuadas duas repicagens: a primeira para preservação e a segunda visando crescimento micelial para posterior extração de DNA. A preservação foi realizada por desidratação de discos de micélio em tubos de vidro ( tubos de penicilina 5 ml) contendo sílica gel. Os tubos foram previamente esterilizados em calor seco (145º C / 3 horas), os quais foram preenchidos até metade do seu volume com sílica gel. Sobre a camada de sílica gel foi adicionado um disco de papel de filtro esterilizado. Sobre os discos de papel, foram transferidos cinco discos de micélio (5mm) contendo esporulação abundante do fungo. Os vidros foram tampados com filme de PVC e mantidos a 15º com 24 horas de luz. Estes isolados servirão para futuros trabalhos (de resistência a fungicidas ou determinação de série de plantas diferenciadoras para determinação de raças, por exemplo) Extração de DNA Os isolados (Tabela 1) foram repicados para placas de Petri contendo meio BDA encoberto por uma folha de papel celofane esterilizada. Quando o crescimento micelial atingiu as bordas das placas, as folhas de papel celofane foram retiradas em 2

4 câmara de fluxo laminar, identificadas e acondicionadas em freezer (-20º C). Das amostras armazenadas procedeu-se a extração de DNA micelial. Para extração de DNA, cerca de 250 mg de micélio de cada isolado foi macerado na presença de nitrogênio líquido em almofariz previamente esterilizado. Em seguida o micélio triturado foi transferido para tubos (Eppendorf) de 1,5 ml, aos quais foi adicionado 500 µl do tampão de extração [CTAB (cationic hexadecil trimethyl ammonium bromide) 1%; NaCl 0,7M; Tris-HCl ph 8,020mM; EDTA 10mM; β-mercaptoetanol 1%]. Os tubos foram agitados em vórtex por 5 segundos e em seguida mantidos a 60 o C por 30 minutos. Aos tubos foram adicionados 500 µl de CIA [Clorofórmio: álcool isoamílico 24:1, v/v], e estes foram centrifugados por 5 minutos. Em seguida adicionou-se em cada tubo 500 µl de isopropanol, os quais são centrifugados mais uma vez por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o tubo lavado com etanol. O DNA é então re-suspendido em tampão TE (Tris-EDTA) Visualização e quantificação do DNA extraído. As amostras foram submetidas à eletroforese em cuba horizontal contendo tampão TBE (Tris-Borato-EDTA) em gel de agarose (1%). Após a eletroforese o gel foi visualizado em transluminador após este ser embebido em solução contendo brometo de etídio. O brometo de etídio interage com a fita dupla de DNA e em contato com os raios ultravioleta emitidos pelo transluminador, emite uma coloração alaranjada, indicando a presença do DNA. Cada gel de agarose comportou 32 amostras (Figura 1), 26 isolados de C. gossypii var. cephalosporioides e seis amostras de DNA com concentração conhecida (padrões de 10, 50 e 100 ng/µl). Por comparação visual foi estimada a concentração de DNA nas amostras (tabela 1) Digestão do DNA genômico total com endonucleases No preparo das amostras para a reação de AFLP, o DNA genômico, após extraído, foi digerido (cortado) com duas enzimas de restrição simultaneamente. Esta etapa gerou o substrato necessário para a ligação e subseqüente amplificação dos fragmentos. Os fragmentos foram gerados pelas enzimas EcoR I e MseI. EcoR I possui um sítio de reconhecimento de 6 pares de bases (pb) na fita dupla de DNA enquanto 3

5 que o sítio de reconhecimento da enzima MseI é de 4 -pb. Quando utilizadas em conjunto, estas enzimas geram pequenos fragmentos de DNA que além de possuírem tamanho ideal para amplificação (<1.000 pb ou 1 kb) também são de tamanho ideal para separação em géis de poliacrilamida. A reação de digestão foi realizada em tubos de 1,5 ml: Componente Controle (DNA de tomate) Amostra (Colletotrichum) Tampão de reação 5X * 5 µl 5 µl Controle (100 ng/µl) 2.5 µl - Amostra (250 ng em 18 µl) - 18 µl EcoR I/ Mse I 2 µl 2 µl Água destilada 15.5 µl Até 25 µl Volume total 25 µl 25 µl * [50 mm Tris-HCl (ph 7.5), 50 mm acetato de magnésio, 250 mm acetate de potássio]. Os tubos foram agitados suavemente e incubados por duas horas a 37º C. Em seguida os tubos foram mantidos por 15 minutos a 70º C visando inativar as enzimas de restrição. Os tubos foram então acondicionados em gelo. 1.7 Ligação dos adaptadores Após a inativação das enzimas de restrição, os fragmentos de DNA genômico foram ligados à adaptadores que possuem seqüência de bases complementar aos terminais gerados pelas enzimas de restrição. Com a ligação dos adaptadores gerou-se o DNA molde para amplificação. Os tubos foram retirados do gelo e a estes foi adicionado 24 µl da solução de ligação [Adaptadores EcoR I/ MseI, ATP 0,4 mm, Tris-HCl 10 mm (ph 7.5), acetato de magnésio 10 mm, acetato de potássio 50 mm] e 1 µl da enzima T4 DNA ligase [1 unit/µl em Tris-HCl 10 mm (ph 7.5), DTT 1 mm, cloreto de potássio 50 mm, 50% glicerol (v/v)]. Os tubos (com volume total de 50 µl) foram agitados suavemente em temperatura ambiente e incubados a 20 C ± 2 C por 2 h. Em seguida, 10 µl da solução foram retirados e o volume foi transferido para um novo tubo de 1,5 ml. A estes novos tubos foram acrescidos 90 µl do tampão TE (Tris-EDTA). Esses tubos foram encaminhados para a etapa de amplificação 4

6 (item1.8). Os tubos iniciais (volume atual de 40 µl) foram armazenados em freezer a 20 C para eventuais repetições. Etapas em andamento: 1.8. Reações de amplificação Reações em cadeia da polimerase (do inglês, Polymerase chain reaction ou PCR) estão sendo realizadas em duas etapas consecutivas. Na primeira reação, ou pré-amplificação, o DNA genômico é amplificado com primers sem nucleotídeos seletivos (primers E+0, M+0). Os produtos resultantes da reação de pré-amplificação são diluídos e utilizados como molde para a amplificação seletiva utilizando dois primers de AFLP contendo zero, um ou dois nucleotídeos seletivos. Para Colletotrichum, testes preliminares utilizando um primer com seqüência do adaptador da enzima MseI e um nucleotídeo seletivo (M-A) em conjunto com outro primer com seqüência do adaptador da enzima EcoRI e dois nucleotídeos seletivos (E-AC) deram os melhores resultados, gerando em torno de 94 bandas. Na reação de pré-amplificação foram adicionados os seguintes componentes em um tubo de 0,5 ml: Componente Volume DNA diluído (obtido na etapa anterior) 5 µl primer E µl primer M-0 12 µl 10X PCR tampão + magnésio* 5 µl Taq DNA polimerase (1 unit/µl) 1 µl Água destilada 25.3 µl Volume total 51 µl * [Tris-HCl 100 mm (ph 8.3), Cloreto de magnésio 15 mm, cloreto de potássio 500 mm] As amostras foram agitadas suavemente, acondicionadas em termociclador e submetidas a 20 ciclos de: 94 C por 30 segundos, 56 C por 60 segundos e 72 C por 60 segundos. Destas amostras, diluiu-se (1:50) transferindo 3 µl da solução para um novo tubo de 1,5 ml contendo 147 µl de tampão TE. Esta quantidade é suficiente para 30 5

7 amplificações seletivas de AFLP. Ambos os tubos (diluídos ou não) foram estocados em freezer a 20 C. A etapa de amplificação seletiv a está dependente da aquisição de mais quantidades da enzima Taq Polimerase. Etapas a serem realizadas (dependentes da liberação da última parcela de recursos) 1.9 amplificação seletiva das amostras; 1.10 Separação dos fragmentos amplificados em gel de poliacrilamida; Quantificação das bandas; Determinação da estrutura genética. 6

8 Resumo: Meta: Obter as amostras representativas de isolados de C. gossypii var. cephalosporiiodes no Estado do Mato Grosso. Aferidor da meta: Número de amostras coletadas Proposta: 200 amostras (janeiro março) Situação: 192 amostras coletadas. Meta: Isolamento e cultivo de C. gossypii var. cephalosporioides a partir das amostras coletadas. Aferidor da meta: Número de isolados Proposta: 200 amostras (abril junho) Situação: 192 isolados in vitro e em tubos de preservação. Meta: Extração de DNA das amostras Aferidor da meta: Número de amostras Proposta: 200 amostras (julho) Situação: 192 isolados com DNA extraído. Meta: Visualização e quantificação de DNA das amostras Aferidor da meta: Número de amostras Proposta: 200 amostras (agosto - novembro) Situação: 192 amostras com DNA quantificado. Meta: Análise AFLP (digestão do DNA, ligação dos adaptadores e amplificação) Aferidor da meta: Número de isolados analisados Proposta: 200 amostras (agosto - novembro) Situação: Amostras digeridas e com adaptadores ligados, estando em fase de aquisição de reagentes para realizar a amplificação seletiva. Meta: Análise AFLP (eletroforese em gel de poliacrilamida e quantificação das bandas). Proposta: 200 amostras (agosto - novembro) Situação: Dependente de reagentes citados no item anterior. 7

9 Elaboração de relatório final Proposta: dezembro - fevereiro 8

10 Tabela 1. Isolados coletados no Estado do Mato Grosso em 2003: código, município, data da coleta, coordenadas geográficas e concentração de DNA extraído da amostra. Código Município Data coleta Georeferenciamento W S Cgc047 Campo Verde o 08' 25" 15 o 14'47" Cgc048 Campo Verde o 08' 25" 15 o 14'47" Cgc049 Campo Verde o 08' 25" 15 o 14'47" Cgc050 Campo Verde o 08' 25" 15 o 14'47" Cgc051 Campo Verde o 08' 25" 15 o 14'47" Cgc052 Campo Verde o 08' 25" 15 o 14'47" Cgc053 Campo Verde o 08' 24" 15 o 14'50" Cgc054 Campo Verde o 08' 24" 15 o 14'50" Cgc055 Campo Verde o 08' 24" 15 o 14'50" Cgc056 Campo Verde o 08' 24" 15 o 14'50" Cgc057 Campo Verde o 08' 24" 15 o 14'50" Cgc058 Campo Verde o 08' 24" 15 o 14'50" Cgc059 Campo Verde o 08' 22" 15 o 14'54" Cgc060 Campo Verde o 08' 22" 15 o 14'54" Cgc061 Campo Verde o 08' 22" 15 o 14'54" Cgc062 Campo Verde o 08' 22" 15 o 14'54" Cgc063 Campo Verde o 08' 22" 15 o 14'54" Cgc064 Campo Verde o 08' 22" 15 o 14'54" Cgc065 Campo Verde o 08' 21" 15 o 14'55" Cgc066 Campo Verde o 08' 21" 15 o 14'55" Cgc067 Campo Verde o 08' 21" 15 o 14'55" Cgc068 Campo Verde o 08' 21" 15 o 14'55" Cgc069 Campo Verde o 08' 21" 15 o 14'55" Cgc070 Campo Verde o 08' 21" 15 o 14'55" Cgc083 Alto Taquari - MT Cgc084 Alto Taquari - MT Cgc085 Alto Taquari - MT Cgc086 Alto Taquari - MT Cgc087 Alto Taquari - MT Cgc088 Alto Taquari - MT Cgc089 Alto Taquari - MT Cgc090 Alto Taquari - MT Cgc091 Alto Taquari - MT Cgc092 Alto Taquari - MT Cgc093 Alto Taquari - MT Cgc094 Alto Taquari - MT Cgc095 Alto Taquari - MT Cgc096 Alto Taquari - MT Cgc097 Alto Taquari - MT Cgc098 Alto Taquari - MT Cgc099 Alto Taquari - MT Cgc100 Alto Taquari - MT Cgc101 Alto Taquari - MT Cgc102 Alto Taquari - MT DNA ng/ µl 9

11 Cgc103 Alto Taquari - MT Cgc104 Alto Taquari - MT Cgc105 Alto Taquari - MT Cgc106 Alto Taquari - MT Cgc107 Sapezal-MT º º Cgc108 Sapezal-MT º º Cgc109 Sapezal-MT º º Cgc110 Sapezal-MT º º Cgc111 Sapezal-MT º º Cgc112 Sapezal-MT º º Cgc113 Sapezal-MT º º Cgc114 Sapezal-MT º º Cgc115 Sapezal-MT º º Cgc116 Sapezal-MT º º Cgc117 Sapezal-MT º º Cgc118 Sapezal-MT º º Cgc119 Sapezal-MT º º Cgc120 Sapezal-MT º º Cgc121 Sapezal-MT º º Cgc122 Sapezal-MT º º Cgc123 Sapezal-MT º º Cgc124 Sapezal-MT º º Cgc125 Sapezal-MT º º Cgc126 Sapezal-MT º º Cgc127 Sapezal-MT º º Cgc128 Sapezal-MT º º Cgc129 Sapezal-MT º º Cgc130 Sapezal-MT º º Cgc131 Lucas do Rio Verde º º Cgc132 Lucas do Rio Verde º º Cgc133 Lucas do Rio Verde º º Cgc134 Lucas do Rio Verde º º Cgc135 Lucas do Rio Verde º º Cgc136 Lucas do Rio Verde º º Cgc137 Lucas do Rio Verde º º Cgc138 Lucas do Rio Verde º º Cgc139 Lucas do Rio Verde º º Cgc140 Lucas do Rio Verde º º Cgc141 Lucas do Rio Verde º º Cgc142 Lucas do Rio Verde º º Cgc143 Lucas do Rio Verde º º Cgc144 Lucas do Rio Verde º º Cgc145 Lucas do Rio Verde º º Cgc146 Lucas do Rio Verde º º Cgc147 Lucas do Rio Verde º º Cgc148 Lucas do Rio Verde º º Cgc149 Lucas do Rio Verde º º Cgc150 Lucas do Rio Verde º º Cgc151 Lucas do Rio Verde º º Cgc152 Lucas do Rio Verde º º Cgc153 Lucas do Rio Verde º º

12 Cgc154 Lucas do Rio Verde º º Cgc155 Rondonópolis - MT º º Cgc156 Rondonópolis - MT º º Cgc157 Rondonópolis - MT º º Cgc158 Rondonópolis - MT º º Cgc159 Rondonópolis - MT º º Cgc160 Rondonópolis - MT º º Cgc161 Rondonópolis - MT º º Cgc162 Rondonópolis - MT º º Cgc163 Rondonópolis - MT º º Cgc164 Rondonópolis - MT º º Cgc165 Rondonópolis - MT º º Cgc166 Rondonópolis - MT º º Cgc167 Rondonópolis - MT Cgc168 Rondonópolis - MT Cgc169 Rondonópolis - MT Cgc170 Rondonópolis - MT Cgc171 Rondonópolis - MT Cgc172 Rondonópolis - MT Cgc173 Rondonópolis - MT Cgc174 Rondonópolis - MT Cgc175 Rondonópolis - MT Cgc176 Rondonópolis - MT Cgc177 Rondonópolis - MT Cgc178 Rondonópolis - MT Cgc179 Pedra Preta - MT º º Cgc180 Pedra Preta - MT º º Cgc181 Pedra Preta - MT º º Cgc182 Pedra Preta - MT º º Cgc183 Pedra Preta - MT º º Cgc184 Pedra Preta - MT º º Cgc185 Pedra Preta - MT º º Cgc186 Pedra Preta - MT º º Cgc187 Pedra Preta - MT º º Cgc188 Pedra Preta - MT º º Cgc189 Pedra Preta - MT º º Cgc190 Pedra Preta - MT º º Cgc191 Pedra Preta - MT º º Cgc192 Pedra Preta - MT º º Cgc193 Pedra Preta - MT º º Cgc194 Pedra Preta - MT º º Cgc195 Pedra Preta - MT º º Cgc196 Pedra Preta - MT º º Cgc197 Pedra Preta - MT º º Cgc198 Pedra Preta - MT º º Cgc199 Pedra Preta - MT º º Cgc200 Pedra Preta - MT º º Cgc201 Pedra Preta - MT º º Cgc202 Pedra Preta - MT º º Cgc203 Itiquira - MT º º Cgc204 Itiquira - MT º º

13 Cgc205 Itiquira - MT º º Cgc206 Itiquira - MT º º Cgc207 Itiquira - MT º º Cgc208 Itiquira - MT º º Cgc209 Itiquira - MT º º Cgc210 Itiquira - MT º º Cgc211 Itiquira - MT º º Cgc212 Itiquira - MT º º Cgc213 Itiquira - MT º º Cgc214 Itiquira - MT º º Cgc215 Itiquira - MT º º Cgc216 Itiquira - MT º º Cgc217 Itiquira - MT º º Cgc218 Itiquira - MT º º Cgc219 Itiquira - MT º º Cgc220 Itiquira - MT º º Cgc221 Itiquira - MT º º Cgc222 Itiquira - MT º º Cgc223 Itiquira - MT º º Cgc224 Itiquira - MT º º Cgc225 Itiquira - MT º º Cgc226 Itiquira - MT º º Cgc227 Primavera do Leste º º Cgc228 Primavera do Leste º º Cgc229 Primavera do Leste º º Cgc230 Primavera do Leste º º Cgc231 Primavera do Leste º º Cgc232 Primavera do Leste º º Cgc233 Primavera do Leste º º Cgc234 Primavera do Leste º º Cgc235 Primavera do Leste º º Cgc236 Primavera do Leste º º Cgc237 Primavera do Leste º º Cgc238 Primavera do Leste º º Cgc239 Primavera do Leste º º Cgc240 Primavera do Leste º º Cgc241 Primavera do Leste º º Cgc242 Primavera do Leste º º Cgc243 Primavera do Leste º º Cgc244 Primavera do Leste º º Cgc245 Primavera do Leste º º Cgc246 Primavera do Leste º º Cgc247 Primavera do Leste º º Cgc248 Primavera do Leste º º Cgc249 Primavera do Leste º º Cgc250 Primavera do Leste º º

14 Figura 1. Gel de agarose contendo DNA genômico de 26 amostras de isolados de Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides e seis padrões de concentração conhecida (λ) 13