Exercício 1. Calcule a concentração dos reagentes listados abaixo em mol L -1 Tabela 1. Propriedades de ácidos inorgânicos e hidróxido de amônio.

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1 ATIVIDADE 2 - CÁLCULO DE CONCENTRAÇÃO Exercício 1. Calcule a concentração dos reagentes listados abaixo em mol L -1 Tabela 1. Propriedades de ácidos inorgânicos e hidróxido de amônio. Exercício 2. Calcule a (massa e/ou volumes e/ou concentração) necessárias para preparar 500 ml das soluções listadas no procedimento abaixo: Fonte: Fundamentos teórico-práticos e protocolos de extração e de amplificação de dna por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase. (http://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/48295/1/livroprotmolecular.pdf) 1. EXTRAÇÃO DE DNA DE AMOSTRAS DE TECIDOS DE MAMÍFEROS 1.1. Material (ver Apêndice) a) Tampão de digestão 1. b) Solução de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico (25:24:1); para essa solução, usar fenol tamponado. c) Acetato de amônio 7,5 M. d) Etanol absoluto. e) Etanol a 70%. f) Tampão TE (tris HCl 10 mm, EDTA 1 mm, com ph 8,0; tris = hidroximetilaminometano). g) Solução de dodecilsulfato de sódio (SDS) a 0,1%. h) Nitrogênio líquido. i) Frascos e bastões esterilizados. j) Microtubos de polipropileno.

2 1.2. Digestão da amostra As amostras de tecidos de origem animal ou vegetal que serão submetidas à extração e DNA devem sofrer fragmentação e digestão enzimática das proteínas. Para produzir a fragmentação, as amostras podem ser cortadas, submetidas a congelamento em nitrogênio líquido e rapidamente pulverizadas por processo manual (utilizando um bastão) ou mecânico (utilizando equipamentos para esse fim). Quantidades da amostra (entre 200 mg e 1 g) são adicionadas a uma solução-tampão de digestão (na proporção de 1,2 ml de tampão para cada 100 mg de tecido) e colocadas em banho-maria em temperatura próxima a 50 C, para que ocorra a digestão. O tempo de incubação pode variar entre oito e dezesseis horas, ou até que a amostra se apresente totalmente digerida, ou seja, apresente aspecto viscoso Extração do DNA com fenol O método mais utilizado para purificação do DNA é a extração com fenol tamponado, que provoca a desnaturação das proteínas de maneira eficiente. O clorofórmio também é usado como agente desnaturante das proteínas contidas na amostra. A mistura de fenol e de clorofórmio é muito eficiente para desproteinizar e sua ação se fundamenta na propriedade hidrófoba das proteínas que apresentam afinidade por solventes orgânicos. O álcool isoamílico previne a formação de espuma quando a mistura é agitada, o que torna mais fácil a separação da fase orgânica e da fase aquosa. A proteína que foi desnaturada pelo tratamento com fenol e clorofórmio forma uma camada na interface das duas fases, separando-se do DNA que se mantém na fase aquosa. Para extrair o DNA de uma amostra, usar igual volume de solução de fenol, de clorofórmio e de álcool isoamílico (25:24:1). A extração com o fenol é dependente do ph. O fenol empregado nas extrações de DNA deve ter o ph próximo de 8,0 (fenol tamponado), já que faixas mais baixas de ph deslocam o DNA para a interface na hora da centrifugação. Em ph 7,0 ou acima, o DNA permanece na fase aquosa e em ph abaixo de 7,0, ele é desnaturado e migra para a fase orgânica. Nesse último caso, o RNA permanece na fase aquosa. Metodologia para tamponamento do fenol está descrita no Apêndice. Após a adição da solução de extração, centrifugar a amostra por dez minutos a g e transferir o sobrenadante para um novo tubo. Cuidado: A manipulação de soluções que contêm fenol exige cuidado, pelo fato de serem extremamente cáusticas, voláteis e irritantes para as mucosas.

3 1.4. Purificação do DNA por meio de precipitação com etanol A precipitação do DNA é feita por meio da utilização de etanol absoluto associado a uma solução com alta concentração de um sal catiônico. O etanol induz a transição estrutural nas moléculas de ácido, fazendo-as se agregarem, com consequente precipitação. A precipitação com etanol absoluto, além de concentrar o DNA, ajuda a remover resíduos de fenol e de clorofórmio presentes na amostra. O etanol a 70% é utilizado para remover resíduos de sais. Embora tanto o cloreto de sódio como o acetato de sódio e o acetato de amônio sejam eficazes na precipitação do DNA, é mais difícil remover o cloreto de sódio, em razão da sua menor solubilidade em etanol. Procedimento: Adicionar meio volume de solução de acetato de amônio 7,5 M e dois volumes de etanol absoluto. Centrifugar a g por cerca de dois minutos (o tempo deve ser ajustado de acordo com a amostra). Eliminar a solução alcoólica e preservar o pellet de DNA. Ressuspender o pellet em etanol a 70% (para eliminar impurezas presentes na amostra), centrifugar novamente a g por dois minutos. Descartar o sobrenadante e deixar secar o pellet de DNA. Ressuspender o DNA em tampão TE (ver item 6.1.f). Para facilitar a completa dissolução do DNA nesse tampão, as amostras podem ser incubadas em agitador a 65 C por algumas horas. Apêndice Preparo do fenol tamponado: a) Colocar 250 ml de fenol líquido em um frasco de vidro de 1 L. b) Adicionar 0,25 g de 8-hidroxiquinolina (antioxidante). c) Adicionar 250 ml de tris base (hidroximetilaminometano) 50 mm. d) Agitar em temperatura ambiente por cerca de quinze minutos (usar agitador magnético). Deixar repousar a 4 C até a separação das fases. Aspirar a fase aquosa com cuidado. e) Adicionar 250 ml de solução tris HCl 50 mm com ph 8,0 e novamente repetir os procedimentos dos itens c e d. Verificar o ph da fase fenólica (para isso pode ser usado o papel indicador) e repetir itens c e d até que o fenol atinja o ph 8,0. f) Finalmente, recuperar a fase fenólica, adicionar 125 ml de solução tris HCl 50 mm com ph 8,0 ou tampão TE (tris HCl 10 mm, EDTA 1mM com ph 8,0) e estocar em frascos escuros a 4 C para uso por até dois meses. g) Nos protocolos de extração, utilizar a fase fenólica (amarelada) da solução de estoque.

4 Solução de EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) 0,5 M (ph 8,0): a) Dissolver 186,1 g de Na2EDTA.2H20 em 700 ml de água. b) Ajustar o ph para 8,0 com solução de NaOH 10 M. c) Adicionar água ultrapura, q.s.p ml. d) Esterilizar em autoclave a 121 C por quinze minutos. Observações: 1) O EDTA é um agente quelante que impede a ação de enzimas sobre o DNA. 2) O EDTA é insolúvel em ph inferior a 8,0; por essa razão, é importante ajustar o ph antes de completar o volume. Solução-tampão tris HCl (hidroximetilaminometano ácido clorídrico) 1 M: a) Dissolver 121 g de tris base em 800 ml de água ultrapura. b) Ajustar o ph com HCl concentrado. Cerca de 70 ml de HCl são necessários para ph 7,4; e 42 ml, para ph 8,0. c) Adicione água ultrapura até completar 1000 ml. d) Autoclavar a 121 C por quinze minutos. Obs.: O tris tem a função de manter constante o ph das soluções. Solução-tampão TE (tris EDTA): a) Tris HCl 10 mm, com ph 7,4, 7,5 ou 8,0. b) EDTA 1mM. Tampão de digestão 1: NaCl 100 mm Tris HCl, com ph 8,0 10 mm EDTA, com ph 8,0 25 mm SDS 0,5% Proteinase K 0,1 mg/ml Solução-tampão TE (tris EDTA): a) Tris HCl 10 mm, com ph 7,4, 7,5 ou 8,0. b) EDTA 1mM Massa molar: Tris, 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol, C 4 H 11 NO 3 : 121,14 g mol -1 (sólido) EDTA, ácido etilenodiamino-tetraacético, C 10 H 14 N 2 Na 2 O 8 : 336,21 g mol -1 (sólido)

5 SDS, dodecil sulfato de sódio, NaC 12 H 25 SO 4 : 288,37 g mol -1 (sólido) Fenol, C 6 H 6 O: 94,11 g mol -1 (líquido) 8-hidroxiquinolina, C 9 H 7 NO: 145,16 g mol -1 (sólido) Acetato de amônio, CH 3 COONH 4 : 77,08 g mol -1 (sólido) Responda: 1) Qual a massa de cada reagente no preparo do tampão de digestão 1? desconsidere o ajuste de ph. 2) Calcular concentração em mol L -1 dos reagentes utilizado no preparo da solução fenol tamponada. 3) Calcule a massa da acetato de amônio usada para preparar a solução 7,5 M. Qual a massa + de NH 4 desta solução? 4) Qual o volume de etanol utilizado para preparar a solução 70%? 5) Qual o volume das soluções Tris-HCl e EDTA necessário para preparar a solução tampão TE? Qual a massa de Tris e EDTA desta solução? 6) Qual a massa de SDS e a concentração em mol L -1?

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