- HIBRIDAÇÃO DE SOUTHERN UTILIZANDO SONDAS NÃO RADIOACTIVAS 1ª

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1 TP3 e TP4 - HIBRIDAÇÃO DE SOUTHERN UTILIZANDO SONDAS NÃO RADIOACTIVAS 1ª Parte: A- Separação em gel de agarose e visualização do DNA cromossómico de S. elodea ATCC após hidrólise com BamHI, EcoRI, HindIII ou PstI; B- Depurinação, desnaturação e neutralização do DNA no gel de agarose; C- Transferência por capilaridade do DNA cromossómico do gel de agarose para uma membrana de nylon com carga positive e fixação do DNA à membrana. 2ª Parte D- Preparação e marcação com digoxigenina do fragmento de DNA a utilizar como sonda (obtido no TP2_B, C, D); E- Pré-hibridação e Hibridação; F- Lavagens restringentes; G- Detecção dos sinais de hibridação. Introdução A técnica de hibridação dos ácidos nucleicos é uma das mais usadas em Biologia Molecular, mas também em diagnóstico clínico e na identificação de agentes patogénicos em produtos alimentares. Por esta razão, nos últimos anos, tem-se intensificado a procura de métodos de marcação de ácidos nucleicos que não utilizem radioisótopos, de modo a poderem ser usados sem qualquer limitação em rotina. Num protocolo básico de hibridação de ácidos nucleicos, a sonda marcada liga-se a uma sequência complementar alvo de DNA ou RNA, sequência esta que se pode encontrar em solução ou imobilizada a um suporte inerte. A sonda marcada é usada para pesquisar a presença ou ausência de determinada sequência alvo na mistura de reacção. Segue-se a detecção do híbrido sonda-molécula alvo, usando um sistema que deve apresentar um alto grau de sensibilidade e selectividade. Neste trabalho, pretende-se detectar e visualizar fragmentos do DNA cromossómico de S. elodea ATCC que contem o gene pgmg com base na técnica de hibridação de Southern. Será usado como sonda o fragmento de DNA que foi amplificado por PCR usando como molde o cromossoma de S. elodea (no TP2). A molécula-alvo será o DNA cromossómico de S. elodea previamente digerido com as enzimas de restrição BamHI, HindIII, PstI ou EcoRI. Utilizar-se-à o sistema comercial DIG High Prime DNA Labeling

2 and Detection Starter Kit I (Roche Applied Science). Este sistema usa digoxigenina (DIG) para marcar a sonda de DNA e a subsequente detecção colorimétrica dos híbridos DNA alvo-sonda com base num ensaio imunoenzimático. Procedimento experimental 1ª parte: A- Separação em gel de agarose e visualização do DNA cromossómico de S. elodea ATCC hidrolisado com BamHI, HindIII, PstI e EcoRI. 1. Usar alíquotas contendo 10 μg de DNA cromossómico que foi sujeito a hidrólise com as enzimas de restrição BamHI, HindIII, PstI e EcoRI num volume total de 20 μl contendo 10 U de enzima. 2. Proceder à sua separação electroforética de acordo com o descrito no ponto C do TP2. 3. Registar os resultados com um sistema de aquisição de imagem para documentação de géis (Bio-Rad; programa Quantity One ). O gel contendo os fragmentos resultantes da hidrólise do DNA cromossómico de S. elodea, separados por electroforese, será em seguida tratado (parte B) e os fragmentos serão transferidos para uma membrana de Nylon (parte C). Esta será posteriormente sujeita ao procedimento de hibridação com a sonda de DNA marcada com digoxigenina (parte E). B- Depurinação, desnaturação e neutralização do DNA no gel de agarose 1. Colocar o gel numa solução 0.25 M HCl, durante 10 minutos à temperatura ambiente, com agitação suave constante. 2. Colocar o gel numa solução 1.5 M NaCl/0.5 M NaOH durante 20 minutos, à temperatura ambiente e com agitação constante. 3. Colocar o gel numa solução 1M Tris.Cl ph 8.0/1.5M NaCl durante 25 minutos à temperatura ambiente e com agitação constante.

3 C- Transferência por capilaridade do DNA cromossómico do gel de agarose para uma membrana de nylon 1. Montar um sistema como o ilustrado na figura 1. Figura 1- Transferência do DNA do gel de agarose para a membrana de nylon. 2. Para transferência do DNA do gel de agarose para a membrana (membrana de nylon carregado positivamente - Boehringer Mannheim) colocar num tabuleiro com fundo plano 4 borrachas da mesma altura de modo a servir de base à colocação de uma placa de vidro com 20x20 cm. 3. Adicionar tampão 10xSSC (preparado com base em tampão 20xSSC = 3M NaCl, 0.3M Na3 Citrato.2H2O, ph 7.0) até atingir o nível da placa de vidro. 4. Colocar sobre a placa de vidro uma folha de papel "Whatman 3MM", de modo a que as extremidades fiquem embebidas no tampão. Ter o cuidado de não deixar bolhas de ar entre o vidro e o papel. 5. Colocar o gel em posição invertida sobre a folha de papel "Whatman 3 MM".

4 6. Passar a membrana de nylon por uma solução 2xSSC durante 2-3 minutos e colocar a membrana sobre o gel. 7. Referenciar as amostras na membrana não esquecendo que o gel foi colocado em posição invertida. 8. Sobre a membrana, colocar duas folhas de papel "Whatman 3 MM" que previamente foram embebidas em tampão 2xSSC. 9. Colocar papel absorvente (8-10 cm de altura) e, por último, um peso de aproximadamente 500 g. Com base neste sistema, a transferência do DNA do gel de agarose para a membrana prolongar-se-á por horas. 10. Remover o papel absorvente e colocar a membrana numa solução 6xSSC durante 5 minutos. 11. Remover o excesso de solução 6xSSC, colocando a membrana entre duas folhas de papel "Whatman 3MM". 12. Fixar o DNA à membrana por exposição à luz ultravioleta, num transiluminador UV, durante 3 minutos. 13. Secar a membrana à temperatura ambientee guardar até posterior utilização.

5 2ª parte: D- Preparação e marcação com digoxigenina (DIG) do fragmento de DNA a utilizar como sonda O fragmento de DNA utilizado como sonda neste trabalho foi obtido por amplificação por PCR a partir de uma região do genoma de S. elodea ATCC 31461, correspondente a parte do gene pgmg que codifica para uma proteína bifuncional com actividades de PGM/PMM (TP 2; v. pag. 58). A marcação do DNA que se pretende utilizar como sonda será efectuada por método enzimático, por ligação de DIG (grupo modificador) (Fig. 2). Para esse fim utilizar-se-á o sistema comercial DIG High Prime DNA Labeling (Roche Applied Science). Este sistema foi construído para marcar sondas de DNA por extensão de iniciadores com sequências aleatórias, em que esses oligonucleótidos hibridam com o DNA desnaturado permitindo a síntese de uma cadeia com uma sequência complementar à deste, por acção de uma DNA polimerase. A presença de um nucleótido marcado com digoxigenina (DIG-dUTP) durante a polimerização, resulta na sua incorporação nas cadeias em formação, originando uma sonda idêntica ao DNA inicial mas com digoxigenina incorporada. Template DNA Primer DIG-dUTP Figura 2- Diagrama representativo da marcação de um fragmento de DNA utilizando iniciadores com sequências aleatórias ("Multi-primer").

6 Técnica: 1. Adicionar num microtubo os seguintes componentes para um volume final de 20 μl: - 1 µg de DNA (proveniente de TP2_secção D) desnaturado pelo calor (5 minutos em água a ferver) Nota: estimar o volume necessário de solução do fragmento de DNA obtido no TP2_D, com base na determinação espectrofotométrica da respectiva concentração no sistema NanoDrop. - água desionizada estéril, de modo a perfazer 16 µl - 4 µl da mistura DIG-High Prime 5x concentrada, fornecida no kit comercial; esta mistura contém concentrações óptimas de: - nucleótidos (DIG-dUTP, datp, dctp, dgtp, dttp); - iniciadores (nonâmeros) aleatórios; - enzima (fragmento Klenow da DNA polimerase I de E. coli); - MgCl 2 e componentes do tampão (ph 7.8). 2. Incubar a mistura à temperatura de 37ºC durante a noite (~ 20 h) (ver Fig. 3). 3. Parar a reacção através da adição de 2 µl de uma solução de EDTA a 0.2 M (ph 8) ou por aquecimento a 65ºC durante 10 minutos. 4. Congelar a solução até posterior utilização, ou colocar o microtubo contendo o DNA num banho de água em ebulição durante 5 minutos, para desnaturar a sonda, e incubar em gelo (se se prosseguir de imediato para a hibridação). Nota: - A marcação da sonda será efectuada pelo docente.

7 - Procede-se também à marcação com digoxigenina de uma mistura de fragmentos padrão 1 Kbp DNA ladder (esta será adicionada à mistura de hibridação em conjunto com a sonda marcada (secção E) e permitirá visualizar os fragmentos de DNA padrão de tamanho conhecido, na membrana de hibridação). Figura 3. Rendimento de DNA marcado com DIG obtido a partir de diferentes quantidades de DNA molde após 1 ou 20h de incubação da mistura de reacção DIG High Prime a 37ºC (publicado no Manual de instruções DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I; Roche Applied Science). Por exemplo, partindo-se de 1000 ng de DNA molde, é de esperar obter aproximadamente 850 ng ou 2300 ng de DNA marcado com DIG se a reacção for conduzida durante 1 ou 20 h, respectivamente.

8 E- Pré-hibridação e Hibridação A membrana de Nylon com o DNA imobilizado será submetido a uma pré-hibridação de modo a minimizar a ligação não específica da sonda, antes de ser sujeita à hibridação com a sonda marcada. Nota: A hibridação será iniciada pelo docente no dia anterior à realização da aula. Técnica: 1. Preparar o tampão de pré-hibridação DIG Easy Hyb de acordo com as instruções do fornecedor, isto é, adicionar cuidadosamente 64 ml de água desionisada estéril (em 2 porções) aos grânulos DIG Easy Hyb e dissolver imediatamente através de agitação durante 5 min a 37ºC. Nota 1: Usar (10 ml / 100 cm 2 de membrana, para a pré-hibridação, e 3.5 ml/100 cm 2 de membrana, para a hibridação) Nota 2: o tampão de pré-hibridação comercial DIG Easy Hyb contém concentrações adequadas de: - solução SSC - dodecil sulfato de sódio (SDS) - líquido de bloqueio - DNA heterólogo de esperma de salmão 2. Aquecer o tampão de pré-hibridação a 55ºC. 3. Passar a membrana de Nylon contendo o DNA fixado (secção C) durante 2 minutos numa solução de 2xSSC. 4. Colocar a membrana no interior de um frasco de hibridação. 5. Adicionar ao frasco contendo a membrana 8 ml de tampão de pré-hibridação previamente aquecido (nota: para membrana com cerca de 7.7 x 10.4 cm, i.e. 80 cm 2 ).

9 6. Incubar durante 30 minutos, com agitação suave, a 55ºC, numa estufa de hibridação (TECHNE, Hybridiser HB-1D). 7. Entretanto, desnaturar pelo calor (5 minutos em banho de água a ferver) a sonda de DNA e a mistura de fragmentos DNA padrão marcados com DIG (secção D) e arrefecer rapidamente no gelo. (nota: cerca de 25 ng de sonda marcada / ml de tampão de hibridação) 8. Remover o tampão de pré-hibridação e adicionar 3 ml de mistura de hibridação constituida por tampão de pré-hibridação fresco ao qual foi adicionada a sonda de DNA desnaturada (nota: misturar bem, mas evitar a formação de bolhas). 9. Incubar durante a noite a 55ºC (ver Nota A), com agitação suave numa estufa de hibridação (TECHNE, Hybridiser HB-1D). Nota A Cálculo da Temperatura de Hibridação apropriada para o sistema DIG Easy Hyb (de acordo com o fornecedor): T optima = T m - 20 to 25ºC T m = (%G+C) (600 / l) l comprimento do hibrido em pares de bases % G+C (gene pgmg) = 66% l = 839 pb Pelo que, T opt = 51 a 56 ºC Nota B: o tampão DIG Easy Hyb contendo a sonda marcada com DIG pode ser armazenada a -15 a -20ºC e ser reutilizada várias vezes, quando desnaturada a 68ºC durante 10 minutos imediatamente antes da sua reutilização. IMPORTANTE - não ferva o tampão DIG Easy Hyb.

10 F- Lavagens restringentes 1. Terminada a hibridação, retirar o tampão e transferir a membrana para uma solução SSC 2x, SDS 0.1%, à temperatura ambiente. Lavar 2 x 5 min, com agitação suave. 2. Incubar 15 minutos com agitação moderada, a 60ºC. 3. Realizar uma nova lavagem a 60ºC, durante 15 minutos, com solução pré-aquecida de SSC 0.5x; SDS 0.1 %. G- Detecção dos sinais de hibridação A detecção de híbridos de DNA resultantes da ligação da sonda a sequências homólogas do DNA cromossómico imobilizado na membrana da nylon, será efectuada por um processo de imunodetecção enzimática, de acordo com o sistema comercial usado. Aos híbridos formados irá ligar-se um anticorpo conjugado, anti-dig-fosfatase alcalina (AP). A enzima repórter fosfatase alcalina irá catalisar a formação de cor a partir dos substratos colorimétricos NBT/BCIP, permitindo a visualização na membrana dos fragmentos do DNA cromossómico de S. elodea ATCC que contém o gene pgmg. Técnica: Todas as incubações devem ser realizadas à temperatura ambiente (15-25ºC). 1. Após as lavagens restringentes, lavar a membrana brevemente (1-5 min) no tampão de lavagem (NaCl 150 mm; Ácido maleico 100 mm, ph 7.5, Tween %(v/v)). 2. Incubar durante 30 minutos em 80 ml de solução de bloqueio (100 ml/100 cm 2 de membrana); preparar a solução de bloqueio no momento, por diluição 1:10 da solução de bloqueio 10x concentrada fornecida no sistema comercial, em tampão M (NaCl 150 mm; Ácido maleico 100 mm, ajustado a ph 7.5 com NaOH (sólido)). 3. Incubar durante 30 minutos em 16 ml de solução de anticorpo (20 ml/100 cm 2 de membrana); para preparar a solução de anticorpo, centrifugar a solução de anti- DIG-AP fornecida no sistema comercial, durante 5 min a rpm no microtubo

11 original, e pipetar o volume necessário cuidadosamente da superfície (diluir a solução anti-dig-ap 1:5000 em solução de bloqueio). 4. Lavar (2x15 min) com 80 ml de tampão de lavagem (NaCl 150 mm; Ácido maleico 100 mm, ph 7.5, Tween %(v/v)). 5. Equilibrar (2-5 min) em 16 ml de tampão de detecção (20 ml/100 cm 2 de membrana; 100 mm Tris-HCl, 100 mm NaCl, ph 9.5). 6. Incubar a membrana em 10 ml de solução de desenvolvimento de cor (200 μl da solução stock de NBT/BCIP em 10 ml de tampão de detecção), preparada imediatamente antes do início da reacção de detecção. Não agitar e manter no escuro (a membrana pode ser exposta à luz momentanemanete para monitorizar o desenvolvimento da cor). 7. Parar a reacção quando a intensidade do sinal/cor for a desejada, através da lavagem da membrana durante 5 min em 50 ml de água desionisada esterilizada ou tampão TE (10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 8.0). 8. Secar a membrana à temperatura ambiente. MANUAIS DE TÉCNICAS DE MANIPULAÇÃO GENÉTICA Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. e Struhl, K., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, Berger, S.L. and Kimmel, A.R." Guide to Molecular Cloning Techniques", Methods in Enzymology, 152, Academic Press, Inc., San Diego, Sambrook, J. and Maniatis, T. Molecular Cloning : A laboratory Manual, (3ª Ed.) Cold Spring Harbor Lab. Press, New York, 1989.