Southern blotting análise de DNA. Northern blotting análise de RNA. Western blotting análise de proteínas

Transcrição

1 Southern blotting análise de DNA Northern blotting análise de RNA Western blotting análise de proteínas

2 Southern blotting

3 Hibridação DNA-DNA em membrana Southern blot Digestão enzimática Eletroforese em gel de agarose Transferência para membrana Hibridação

4 Hibridação DNA-DNA em membrana Southern blot Digestão enzimática

5 Hibridação DNA-DNA em membrana Southern blot Digestão enzimática

6 Hibridação DNA-DNA em membrana Southern blot Eletroforese em gel de agarose

7 Hibridação DNA-DNA em membrana Southern blot Tratamento do gel 1. Depurinação dos fragmentos de DNA (hidrólise de bases purinas) lavar em HCl 2. Denaturação do DNA lavar em NaOH e NaCl 3. Neutralização do DNA lavar em tampão Tris e NaCl

8 Hibridação DNA-DNA em membrana Southern blot Transferência por capilaridade

9 Hibridação DNA-DNA em membrana Southern blot Tranferência a vácuo

10 Hibridação DNA-DNA em membrana Southern blot Transferência por corrente elétrica

11 Hibridação DNA-DNA em membrana Southern blot Fixação do DNA à membrana Incubação a 80 0 C Tratamento alcalino UV cross-linking

12 Hibridação DNA-DNA em membrana Southern blot

13 Hibridação DNA-DNA em membrana Southern blot Denaturação da sonda (quebra das pontes de H) Alta temperatura (95 0 C) Agentes denaturantes Condições alcalinas (alto ph)

14 Hibridação DNA-DNA em membrana Southern blot Hibridação Membrana é colocada em contato com a solução de hibridação (solução salina + solução de bloqueio + sonda denaturada) Função: hibridação da sonda ao segmento de ácido nucléico complementar presente na membrana Garrafas de hibridação forno de hibridação Bolsas de hibridação banho maria

15 Hibridação DNA-DNA em membrana Southern blot Lavagens Membrana é colocada em contato com soluções contendo detergentes e agentes desnaturantes Função: remoção de sonda marcada: - em excesso - ligada não-especificamente - ligada a regiões de pouca complementariedade de bases - menor quantidade de sal - aumento da temperatura - uso de denaturantes

16 Hibridação DNA-DNA em membrana Southern blot Revelação Visualização Função: visualização dos sinais de hibridação

17 Hibridação DNA-DNA em membrana Southern blot DNA genomico Digestão com enzimas de restrição Fragmentos de DNA Separação dos fragmentos por eletroforese em gel de agarose Revela o filme Analisa hibridação sonda Denatura DNA e transfere membrana de mylon Incubar membrana com sonda e lavagens Expor membrana ao filme de raio X

18 Hibridação DNA-DNA em membrana Southern blot

19 Hibridação de DNA imobilizado na membrana Exemplo

20 Tipagem molecular de transgenia por southern blot Exemplo Genotipagem Molecular Southern-blot Sonda = gene TSG-14 Sítios de restrição da enzima NCOI Wt 8.3 kb 10 kb Tg2 8.3 kb 8.3 kb 5 kb 6 kb Wt Tg4 Tg2 Tg4 8.3 kb 8.3 kb 8.3 kb 8.3 kb 8 kb 6 kb 6 kb 2.5 kb

21 Northern blotting

22 Hibridação RNA-DNA em membrana - Northern blot Hibridação em northern é utlizada para avaliar os padrões de expressão bruta de um gene A-extração de RNA total B-fracionamento por tamanho de amostras de RNA total (ou de mrna poli(a)+ purificado) por eletroforese em gel desnaturante(formaldeído) C-transferênciadas moléculas separadas no gel para um suporte sólido(nc ou nylon) D-hibridaçãocom sondas moleculares específicas E-auto-radiografia - Exposição da membrana ao filme de raio X e revelação. Detecta a presença de sequencia complementar ao cdna presente na amostra

23 Hibridação RNA-DNA em membrana Northern blot

24 Hibridação em northern blotting Comparação direta entre abundancia de mensageiros entre amostras em membrana Método de preferencia para determinação de tamanho de transcritos e para detecção de transcritos de splicing alternativo

25 Hibridação RNA-DNA em membrana Northern blot

26 Análise de expressão gênica Hibridação em northern com sonda do gene FMR1 (síndrome de retardo memtal do X frágil) Níveis mais elevados são detectados no cérebro e nos testículos (4,4Kb), com decréscimo da expressão na placenta, nos pulmões e os rins, respectivamente. Múltiplos transcritos menores estão presentes no coração

27 Colony blot

28 Colony blot

29 Colony blot

30 Dot blot

31 Dot blot

32 Dot blot

33 Dot blot

34 Macroarray