Genética Molecular. Fundamentos Aplicações científicas Biotecnologia

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1 Genética Molecular Fundamentos Aplicações científicas Biotecnologia

2 Genética Molecular DNA RNA Proteínas

3 Universo Celular

4 Ciclo celular

5 Ciclo Celular: Mitose

6 Célula animal

7 Núcleo Celular: Cromossomas

8 Cromossoma: gene

9 DNA Ácido Desoxirribonucléico Informação genética codificada

10 DNA Estrutura e composição

11 DNA: dupla Hélice

12 Molécula de DNA: Uma Molécula de DNA: Dupla Hélice Duas cadeias ou fitas de nucleotídeos. Polímero de nucleotídeos

13 Nucleotídeos Açúcar + Fosfato + Base nitrogenada Freitas, T.R.P. 2009

14 Açúcar: Pentose Pentose: cinco átomos de carbono Desoxirribose DNA Ribose RNA

15 DNA: Quatro bases nitrogenadas Purinas Pirimidinas

16 DNA: Pareamento de Bases

17 DNA: Disposição dos Nucleotídeos

18 DNA: arranjo antiparalelo

19 Dupla Hélice: visão geral

20 RNA Ácido Ribonucléico Informação genética transcrita Estrutura e composição

21 RNA: composição Similar ao DNA: Polímero de nucleotídeos

22 RNA: Ribose

23 Bases Nitrogenadas: Adenina, Uracila, Guanina, Citosina

24 RNA: Estrutura Fita única Altamente reativo Menos estável

25 RNA: tipos e funções RNA mensageiro - mrna: carrega a informação (código genético) para síntese protéica Tradução RNA transportador ou transferência - trna: transporta o aminoácido até o maquinaria de tradução. RNA ribossômico - rrna: compõe a estrutura física do ribossoma, local onde se processará a tradução.

26 Mecanismos Moleculares na célula Replicação do DNA Transcrição: RNA Tradução do RNA: proteínas

27 Mecanismos moleculares Replicação do DNA Nova molécula de DNA Transcrição do DNA Produz moléculas de RNA Tradução do RNA Produção de Proteínas

28 Replicação do DNA Replicação: Uma molécula de DNA dupla fita (parental) pode se duplicar originando duas moléculas de DNA (filhas). Dinâmica: a duplicação do DNA envolve a ação simultânea e integrada de: Enzimas DNA polimerase, Primases, Helicases, etc Vários fatores protéicos Nucleotídeos e RNA

29 Replicação do DNA

30 Replicação: Semiconservativa

31 Transcrição do DNA Transcreve a mensagem genética do DNA Síntese de RNA

32 Transcrição do DNA: Síntese de RNA Procariotos RNA polimerase separa os pares de base do DNA, desenrolando o DNA, dando início a síntese de RNA, formando uma bolha de transcrição no DNA. Proteína transcrição: Fator Sigma. Eucariotos 3 classes de RNAs polimerases no núcleo: Polimerase I: sintetiza o precursor de rrna (subunidade maior). Polimerase II: sintetiza precursores dos mrnas. Polimerase III: sintetiza os RNAs pequenos, os trnas e o rrna ribossômico (subunidade menor) Várias proteínas: Fatores de transcrição (TF)

33 Transcrição: Uma cópia do gene (DNA) é transcrita em RNA

34 Transcrição do mrna

35 mrna RNAm contém uma seqüência linear de bases que são complementares ao DNA que serviu de molde.

36 Tradução Síntese de Proteínas

37 Tradução: Síntese de proteínas RNA mensageiro RNA transportador Ribossomas Vários fatores protéicos Enzimas

38 Tradução

39 Transcrição/Tradução

40 Dogma Central

41 Genomas

42 Tecnologia do DNA recombinante Caracterização genômica e Diagnóstico viral Quimeras Vacinas: nova geração

43 Vírus Parasitas intracelulares obrigatórios Genoma: DNA ou RNA Simples ou complexos Mecanismos de replicação Utilizam a maquinaria celular Interferem no metabolismo celular

44 Vírus: genoma DNA DNA fita dupla: Herpesvírus (Aujeszky) DNA fita dupla: Poxvírus (vaccinia) DNA fita simples circular: Circovírus

45 Vírus genoma RNA RNA fita simples (+): Vírus da Peste Suína Clássica RNA fita dupla: Bluetongue RNA fita (-): Influenza aviária RNA fita (-): vírus da doença de Newcastle

46 Métodos Moleculares Conhecimentos precursores

47 Eletroforese em gel Técnica de separação de moléculas Migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho: Poros do gel Menor massa - migração maior

48 Eletroforese SDS - PAGE Agarose- ácido nucléico

49 Fragmentos de DNA

50 Enzimas de Restrição (1953): fenômeno de restrição/modificação Bacteriófago Nucleases bacterianas específicas Clivagem de DNA estranho Restrição Degradação do DNA estranho Modificação Proteção do próprio DNA

51 Enzimas de restrição clivagem do DNA: Tesouras moleculares

52 Plasmídeos

53 Aplicação direta Enzimas de restrição Padrões de corte Mapas de restrição Tecnologia do DNA Recombinante Clonagem Vetores Inserção e deleção de genes

54 Mapa de restrição: Herpesvirus suíno 1 (doença de Aujeszky)

55 Técnicas de Hibridização de ácidos nucléicos Pareamento dos nucleotídeos em fitas complementares de DNA ou RNA

56 Hibridizações Hibridização in situ Sondas ou Probes Blotting Southern blotting Northern blotting

57 Hibridização: conceito

58 Hibridização in situ - ISH Pareamento: DNA-DNA; DNA-RNA; RNA-RNA Detecção de DNA ou mrna: Localizar com precisão um gene específico ou seus transcritos em um tipo de população celular ou áreas. Detectar a presença do DNA ou RNA infecciosos em processos patológicos. Oncogênese

59 Hibridização in situ

60 Sonda fluorescente

61 Teste de paternidade

62 Clonagem genética Fundamentos e aplicações

63 Clonagem Origem do termo - Genética Bacteriana uma colônia de bactérias como um clone porque todos os indivíduos são geneticamente idênticos à bactéria inicial. Clonagem molecular: isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas.

64 Clonagem: precursores Seleção do vetor: Plasmídeos, Levedura, Vírus Seleção do local para inserção de gene estranho: mapa de restrição

65 1o. estágio inserto vetor

66 2o. estágio

67 Clonagem: shot gun Técnica aplicada sobre o DNA purificado de Herpes clonagem em E.coli

68 Clonagem: várias aplicações

69 Vacinas recombinantes nova geração

70 Vacinas de nova geração Inativadas Vacinas de subunidades Proteínas sintéticas Vacinas Vivas deletadas Vivas Recombinantes vetor Vacinas DNA

71 Precursores para as vacinas Primeiramente: identificação de proteínas imunogênicas do agente infeccioso resposta imune similar ao vírus íntegro. Em segundo lugar: identificação das proteínas que não são necessárias: não imunogênicas, não atuem na replicação e nem estejam relacionadas com a virulência. Deleção

72 Vetores de expressão Genes que codificam as proteínas de interesse: selecionados, clonados e expressos usando vetores. Principais vetores: E. coli, Leveduras, Baculovirus

73 Vacinas recombinantes Vacinas de subunidades: Febre aftosa Peste suína clássica Vacinas Vivas deletadas: Doença de Aujeszky Vivas Recombinantes: Febre aftosa Peste suína clássica Peste suína clássica Gene da Proteína E (envelope) O gene da gp 55 foi clonado e expresso em baculovirus. Ensaio em suínos Produção de anticorpos neutralizantes Aprimoramento

74 Vacina DNA

75 Transgenes Transgênicos Inserção de um gene estranho no patrimônio genético de outro organismo

76 Organismos geneticamente modificados OGM Tabaco com luciferina

77 Transgenia Aplicação da tecnologia do DNA recombinante Seleção do gene, cortes com enzimas, clonagem ou amplificação, purificação, avaliação do produto Inserção no organismo alvo

78 Transferência do DNA

79 Em plantas

80 Resistência a pragas: Bacillus thuringiensis - BT Seleção do gene da proteína tóxica para a praga gene CRY (crystal protein gene)

81 Gene CRY cry gene Agrobacterium tumefaciens Bacillus thuringiensis

82 Clonagem do cry gene

83 Milho transgênico - Bt Clonagem e amplificação do gene cry1c, no controle da Lagarta-do-cartucho Embrapa Sete Lagoas, 2005.

84 Enriquecimento das plantas Plantas modificadas para produzir menos ácidos graxos saturados. Utilização: produção de margarinas menos prejudiciais à saúde. Arroz dourado, maior teor de betacaroteno, precursor da vitamina A. Pensa-se também em desenvolver um arroz com teor aumentado de ferro, para controlar a anemia. Batata com gene da bactéria Escherichia coli, funciona como uma vacina contra a diarréia causada por essa mesma bactéria e imuniza contra a cólera.

85 Comerciais Cenoura Betasweet : Mais doce do que as comuns, contém doses extras de betacaroteno. Batata: Não fica escura depois de descascada. Seleção e inversão da seqüência do gene do escurecimento (Austrália) Melão : mais resistente a vírus (Upjohn, EUA) Ervilha: conservação (DNA Plant Tecnology, EUA)

86 Mais exemplos Milho - Cry gene Soja Broto de Trigo Algodão

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