Extração de DNA. Prof. Silmar Primieri

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1 Extração de DNA Prof. Silmar Primieri

2 Conceitos Prévios O que é DNA? Onde se localiza o DNA na célula? Do que são formadas as membranas celulares? Qual a estrutura do DNA?

3 O que é DNA? Unidade básica informacional do DNA é o gene. Ser humano possui em torno de 30mil genes Tamanho do genoma dos organismos é relativo a sua complexidade. Virus 5-10 pb E. coli 4,640 pb Humano 2,900,000 pb

4 Onde se localiza o DNA na célula?

5 Do que são formadas as membranas celulares? A lise celular é o processo de ruptura ou dissolução da membrana celular que leva à morte da célula e liberação de seu conteúdo.

6 Qual a estrutura do DNA? DNA (acido dosoxirribonucleico) e RNA (ácido ribonucleico) estoca e transfere a informação genética dos organismos vivos. DNA: maior constituinte do núcleo representação estável de completa composição genética de um organismo RNA: encontrado no núcleo e citoplasma chave para o fluxo de informação dentro de uma célula

7 Extração de DNA Extração de DNA é um procedimento de rotina para isolar e coletar o DNA. É a primeira etapa para subsequente análise molecular ou forense. DNA pode ser extraído de quase qualquer tecido celular intacto: Pele Sangue Saliva Sêmen Muco Músculo Osso Outros...

8 Propósito da extração do DNA Obter DNA em uma forma relativamente purificada o qual poderá ser utilizado em investigações Tipo de tecido para transplante Detecção de patógenos Testes de paternidade Identificação de doenças congênitas Identificação de genes problemáticos Pesquisa

9 Etapas básicas para extração de DNA Existem 3 etapas básicas na extração de DNA, os detalhes vão depender do tipo de amostra e de qualquer substância que pode interferir com a extração e análise: Romper as células e remover a membrana lipídica; Remover proteínas celulares ligadas ao DNA que pode ser, por adição de uma protease, por precipitação com acetato de sódio ou de amônio, ou utilizando um passo de extração com fenol/clorofórmio. Precipitar o DNA em etanol frio ou isopropanol, o DNA é insolúvel no álcool e adere-se em conjunto, esta etapa também remove os sais.

10 Lise celular Na extração de DNA de plantas, esta etapa se refere a quebra da parede celular e membrana plasmática A parede celular (feita de celulose) é rompida pela força mecânica (por exemplo, moagem das folhas)

11 Lise celular Em seguida, a adição de um detergente que rompem as membranas celulares Os detergentes são capazes de romper as membranas devido à sua natureza anfipática (tendo ambas as regiões hidrofílicas e hidrofóbicas). As moléculas de detergente são capazes de separar as membranas O resultado final da lise é que o conteúdo das células de plantas são distribuídos em solução.

12 Precipitação Etapa em que o DNA é separado do restante dos componentes celulares. A primeira parte usa fenol/clorofórmio para remover as proteínas do DNA

13 Precipitação A segunda parte é a adição de sais, que interrompem as ligações de hidrogênio entre a água e a molécula de DNA O DNA é então precipitado separando das proteínas usando isopropanol ou etanol. Com o uso de uma microcentrífuga, o DNA forma um pellet no fundo do recipiente

14 Lavagem e Ressuspensão Lavagem O DNA precipitado é carregado com sais de acetato. É "lavadas" com uma solução de etanol a 70% para remover os sais e outras impurezas solúveis em água. Ressuspensão O DNA limpo é agora ressuspenso num tampão para garantir a estabilidade e armazenamento à longo prazo.

15 Revisão do processo de extração de DNA Quebra da parede e membrana celular Separação dos sólidos do DNA dissolvido através de centrifugação. DNA dissolvido Precipitação do DNA usando isopropanol Lavagem e secagem do pellet de DNA com Etanol. Centrifugação para separar o DNA dos sais e açucares dissolvidos.

16 Checando a qualidade do DNA O produto da extração do DNA serão utilizados nas experiências subsequentes. DNA de má qualidade não terá um bom desempenho no PCR. Você vai avaliar a qualidade de sua extração de DNA utilizando o seguinte protocolo: Misturar 10 ul de ADN com 10 ml de tampão de carregamento Coloque esta mistura em um gel de agarose a 1% Analisar os resultados

17 Resultados esperados Abaixo encontra-se um gel de agarose que tem cinco amostras de DNA genômico a partir de várias plantas. Note que o DNA corre com um peso molecular muito elevado e como uma banda clara, espessa. Este DNA foi extraído em um laboratório de pesquisa 1 kbp and 100 bp ladders em condições ideais. Genomic DNA of 5 species of cereals

18 Uma comparação de métodos de extração de DNA usados em laboratórios de pesquisa e ensino Pesquisa Ensino Lysis: moer em N2 líquido e uso de detergente Precipitação Parte I: phenol/chloroformio para se livrar das proteínas Precipitação Parte II: adição de sais para romper as ligações de hidrogênio entre a água e o DNA Precipitação Parte III: adição de etanol para retirar o DNA da solução Lavagem e Ressuspensão: DNA é lavado com etanol, seco e ressuspenso em H20 ou TE buffer. Lysis: moer em argamassa / pilão e uso de detergente Precipitação Parte I: Nenhuma (químicos muito perigosos) Precipitação Part II: adição de sais para romper as ligações de hidrogênio entre a água e o DNA Precipitação Parte III: adição de etanol para retirar o DNA da solução Lavagem e Ressuspensão: DNA é lavado com etanol, seco e ressuspenso em H20 ou TE buffer.

19 Resultados esperados para DNA extraído em laboratório de ensino Pista A: Cevada Pista B: Milho Pista C: Aveia Pista D: Arroz Pista E: Trigo Note que o DNA foi cortado (particularmente para o trigo) - divididos em numerosos fragmentos e não é uma banda única limpo na parte superior - estes são meados variavam os fragmentos de tamanho ( ,000bp faixa de tamanho) As faixas brilhantes no gama 1000 pb são RNA, que também fica extraído usando este protocolo Ladder A B C D E

20 https://www.youtube.com/watch?v=m1qo1iglt5o https://www.youtube.com/watch?v=vo50-zrqtuy

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