Técnicas de análise de proteínas. Estrutura secundária da enzima COMT

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Sonia Bacelar Benke
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1 Técnicas de análise de proteínas Estrutura secundária da enzima COMT

2 Fundamento e aplicação das técnicas de análise de proteínas Electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) Hibridação Western Electroforese bidimensional (2D-PAGE) Imunoprecipitação Sistema de dois híbridos em levedura Sistema de phage display Espectrometria de massa

Western Electroforese bidimensional (2D-PAGE) Imunoprecipitação

3 Electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) (1) A velocidade de migração em campo eléctrico depende da dimensão, forma e carga das moléculas. Para a desagregação e desnaturação das proteínas utiliza-se SDS, β-mercaptoetanol ou DTT (agentes redutores) e calor. O SDS (detergente fortemente aniónico) proteínas carga negativa. confere às

Para a desagregação e desnaturação das proteínas utiliza-se SDS, β-mercaptoetanol ou

4 SDS-PAGE (2) Coloração do gel com azul de coomassie

5 Electrotransferência de proteínas

6 Hibridação Western (Imuno-hibridação) (1) Em (A) e (B) foram utilizados anticorpos da distrofina diferentes. A hibridação Western detecta proteínas que foram separadas por electroforese em gel de poliacrilamida e transferidas para uma membrana.

A hibridação Western detecta proteínas que foram separadas

7 Hibridação Western (2) Esta técnica permite detectar a presença ou ausência de uma proteína que reage com o anticorpo; determinar a sua dimensão e avaliar os níveis relativos de expressão em diferentes amostras. A dimensão da proteína na amostra 5 é diferente, talvez devido a modificação pós-traducional.

avaliar os níveis relativos de expressão em diferentes amostras.

8 Electroforese bidimensional (2D-PAGE) A ph elevado as proteínas estão negativamente carregadas. A ph baixo as proteínas estão positivamente carregadas. Proteínas básicas pi intermédio Proteínas acídicas Gel de focagem isoeléctrica Na análise de proteomas a matriz é de poliacrilamida com um gradiente de ph imobilizado (IPG) para haver maior reprodutibilidade nos resultados. SDS-PAGE O ponto isoeléctrico (pi) é a posicão em que a carga da proteína é neutra relativamente ao ph local.

Proteínas básicas pi intermédio Proteínas acídicas Gel de focagem isoeléctrica Na análise de proteomas a matriz é de

9 Poder de resolução do gel bidimensional A gama de ph mais estreita aumenta o poder de resolução das proteínas. As imagens representam prroteínas do fígado de ratinho separadas por 2D-PAGE e coradas com nitrato de prata. No gel em que a gama de ph é mais larga (3-12) a maioria das proteínas estão concentradas no meio, reflectindo o facto de que a maioria das proteínas têm valores de pi na gama 4-7. Uma proteína pode ocorrer em diferentes posições num gel 2D, por exemplo como consequência de diferenças na modificação pós-traducional.

No gel em que a gama de ph é mais larga (3-12) a maioria das proteínas estão concentradas no meio, reflectindo o facto de que a

10 Imunoprecipitação Proteínas radioactivamente marcadas são incubadas com um anticorpo, que forma complexos com a proteína (o antigénio) contra a qual é dirigido. Estes complexos antigénio-anticorpo são colhidos em esferas que se ligam ao anticorpo e isolados por centrifugação. As esferas são fervidas para dissociar os complexos, e as proteínas recuperadas são analisadas por SDS-PAGE. A proteína radioactiva que foi imunoprecipitada é detectada por auto-radiografia.

Estes complexos antigénio-anticorpo são colhidos em esferas que se ligam ao anticorpo e isolados por centrifugação.

11 Fundamento Sistema de dois híbridos em levedura (1) O sistema de dois híbridos em levedura permite detectar in vivo interacções proteína-proteína. Figure by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter..

12 Fundamento: Sistema de dois híbridos em levedura (2) A proteína alvo é fundida com o domínio de ligação a DNA que a localiza na região reguladora de um gene repórter, onde funciona como isco (bait). Quando esta proteína alvo se liga a uma outra proteína ( presa, prey), no núcleo da célula, especificamente construída em fusão com o domínio de activação da transcrição, a sua interacção leva à aproximação dos dois módulos do activador transcricional, o que desencadeia a expressão do gene repórter. O gene repórter, em geral, permite o crescimento em meio selectivo (Ex.: gene His3). Também se utiliza como gene repórter lacz. As proteínas de fusão bait e prey são obtidas por técnicas padrão de DNA recombinante. Na maioria dos casos, uma única proteína bait é utilizada para pesquisar outras proteínas com as quais interage, partindo de um conjunto de proteínas prey produzidas por ligação do DNA codificante do domínuio de activação de um activador transcricional a fragmentos de DNA de uma biblioteca de cdna.

aproximação dos dois módulos do activador transcricional, o que desencadeia a expressão do gene repórter. O gene repórter, em geral, permite o crescimento em meio selectivo (Ex.: gene His3).

13 Sistema de dois híbridos em levedura (3) Procedimento

14 Sistema de dois híbridos em levedura (4) Os domínios do factor de transcrição não têm de estar covalentemente ligados, mas devem formar uma proteína dimérica. Os factores de transcrição funcionais são detectados pela activação de um gene repórter.

ligados, mas devem formar uma proteína dimérica.

15 Sistema de dois híbridos em levedura (5) Os falsos positivos são devidos a: Autoactivação espontânea do gene repórter pelo bait ou pelo prey Interacção não específica Interacção irrelevante porque ocorre entre proteínas encontradas em compartimentos separados. Os falsos negativos são devidos a: Erros de PCR na produção de cdna Condições não fisiológicas, uma vez que o teste ocorre no núcleo e as proteínas de outros compartimentos podem não adquirir a conformação ou a agregação correcta.

16 Vectores de clonagem utilizados no sistema de dois híbridos em levedura

17 Sistema de phage display (1) O phage display é uma forma de clonagem de expressão de genes estranhos em fagos. Os cdnas são clonados de modo a expressar proteínas estranhas na superfície dos fagos, o que permite o estudo de interacções proteína-proteína in vitro. O gene III codifica uma proteína secundária da cápside do fago f1. O local de clonagem está situado na região que corresponde à extremidade N-terminal da proteína codificada pelo gene III. Uma biblioteca fágica de expressão é produzida a seguir à transfecção de E. coli.

proteína-proteína in vitro. O gene III codifica uma proteína secundária da cápside do fago f1.

18 Sistema de phage display (2) Os recombinantes com insertos na mesma fase de leitura do gene III originam proteínas de fusão em que o componente N-terminal consiste na sequência da proteína estranha.

19 Sistema de phage display (3) A purificação de afinidade utilizando um anticorpo específico de uma das proteínas estranhas permite a identificação de sequências de cdna que codificam a proteína não caracterizada.

das proteínas estranhas permite a identificação de

20 Sistema de phage display (4) As bibliotecas de phage display são utilizadas na triagem de proteínas ou péptidos com propriedades farmacológicas, enzimáticas ou antigénicas. A identificação de um péptido que se liga a um ligando pode ter utilização directa na investigação de um agente terapêutico ou fornecer informação acerca da sequência parcial de uma proteína maior de ligação ao ligando.

A identificação de um péptido que se liga a um ligando pode ter utilização directa na

21 A era pós-genómica Genómica é o estudo de genomas completos. Genoma é a informação genética total numa célula particular ou organismo. Transcritómica é o estudo do transcritoma. Transcritoma é a população de mrnas expressos numa única célula ou tipo de célula. Proteómica é o estudo do proteoma. Proteoma é o conjunto completo de proteínas codificadas pelo genoma.

22 Limitações da genómica O número de genes (ORFs) encontrados no genoma humano é muito menor do que o número de proteínas expressas (splicing alternativo, modificações pós-traducionais, clivagem proteolítica) e por isso, é necessária mais informação acerca das unidades funcionais da célula. O genoma é na sua maioria estático (numa geração) enquanto o proteoma é mais dinâmico ciclo celular, desenvolvimento, resposta ao ambiente. Os níveis de mrna, em geral, não têm correlação com os níveis de expressão proteica (diferente estabilidade dos mrnas e diferentes eficiências de tradução). A maioria das modificações pós-traducionais vulgarmente observadas nas proteínas não podem ser estudadas ou previstas com rigor a partir do genoma.

23 Espectrometria de massa A espectrometria de massa é uma técnica poderosa que permite determinar a massa molecular de proteínas/péptidos e a sequência de aminoácidos. Esta informação é utilizada para identificar a proteína, pesquisando bases de dados de sequências de nucleótidos e de proteínas. Também é utilizada para determinar o tipo e localização das modificações pós-traducionais das proteínas.

24 Espectrómetro de massa A maioria dos espectrómetros de massa possuem: Uma fonte de ionização (produz iões moléculas carregadas) Um ou mais analisadores de massa (separa os iões) Umdetector (conta iões) Sistema de vácuo Amostras 2-DE Fonte de ionização Analisador de massa Detector Sistema de recolha de dados Minimiza colisões, interferências

25 Espectrometria de massa em tandem Genetics From Genes to Genomes

26 Análise da expressão génica Os parâmetros importantes na expressão génica são o material de estudo, a resolução da expressão e a eficiência (o número de genes/proteínas que podem ser analisados de uma só vez).

27 Da proteína ao gene e do gene à proteína (1) O conhecimento da biologia molecular das células torna experimentalmente possível partir do estudo do gene para a proteína e da proteína para o gene. Uma pequena quantidade de proteína purificada é utilizada para se obter uma sequência parcial de aminoácidos. Esta informação permite identificar o gene correspondente numa biblioteca de DNA. Uma vez clonado o gene, a sequência codificante da proteína pode ser inserida num vector de expressão de modo a produzir grandes quantidades da proteína a partir de células obtidas por engenharia genética.

28 Da proteína ao gene e do gene à proteína (2)

29 Engenharia de proteínas Alteração da composição de bases e/ou dos codões do gene para melhorar a sua expressão. Introdução de alterações específicas na sequência de DNA para melhorar as características da enzima (aumentar a especificidade pelo substrato). Produção de proteínas totalmente novas.

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