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7 Exame de Laboratórios de Bioquímica e Biofísica Licenciatura em Bioquímica 1ª Época 27 de Junho de 2006 Por favor responda às questões da 1ª parte e 2ª partes em folhas separadas 1ª Parte 1. Suponha que possui um composto que reage com proteínas dando origem a um produto corado. Como verificava se o podia utilizar para quantificar proteínas? (2.0 val.) 2. Considere os resultados apresentados abaixo resultantes da análise de uma mistura proteica na qual se encontra uma proteína, proteína 14, que se pretende purificar. A Coloração de Coomassie de um gel de electroforese bidimensional. B Immunoblotting da electroforese bidimensional A. B. a) Explique sumariamente em que consiste uma electroforese bidimensional. (1.0 val.) b) De acordo com os resultados apresentados proponha um processo de purificação da proteína 14 utilizando três passos de purificação. Justifique as suas opções. (2.0 val.) c) Como justifica o aparecimento de duas bandas no immunoblotting? O que poderia fazer para confirmar as suas hipóteses? (2.0 val.) 3. O diagnóstico de algumas doenças (em alguns casos doenças infecciosas) é feito por pesquisa de antigénios no soro dos indivíduos supostamente infectados usando a técnica de ELISA. Justifique a utilização desta técnica neste tipo de diagnóstico. (1.5 val.)

8 4. Um dos trabalhos práticos realizados consistiu na purificação da TTR semi-purificada produzida em E. coli usando uma coluna HiTrap em que se imobilizou um anticorpo anti-ttr. Que tipo de técnica de isolamento foi utilizada neste trabalho? Justifique a sua utilização apenas nesta fase da purificação. (1.5 val.) 2ª Parte 5. Para a cristalização de proteínas, recorre-se frequentemente a métodos de difusão de vapor. a) Descreva o fundamento desses métodos. (1.5 val.) b) Explique o interesse de fazer experiências em condições de diferente solubilidade da proteína. (1.0 val.) 6. Considere experiências de difracção utilizando duas grelhas quadradas G1 e G2, sendo que a distância entre os filamentos na grelha G1 é o dobro da distância entre os filamentos na grelha G2. Para as mesmas condições experimentais, diga com qual das grelhas é que se obtém o padrão de difracção em que os pontos estão mais afastados. Justifique. (2.5 val.) 7. Os resultados experimentais dos estudos de cristalografia de raios-x de proteínas são normalmente depositados no Protein Data Bank (PDB). a) Em que consiste a informação acessível no PDB e qual a importância desta base de dados no âmbito da investigação em biologia estrutural? (1.0 val.) b) O RasMol e o DeepView são programas que podem utilizar informação do PDB. Faça uma análise comparativa das suas potencialidades e limitações (1.5 val.) 8. Descreva genericamente o processo de centrifugação diferencial para a preparação de fracções sub-celulares e indique, justificando, como pode ser avaliada a qualidade do fraccionamento obtido. (2.5 val.)

9 Exame de Laboratórios de Biofísica / Bioquímica Época Normal Licenciatura em Bioquímica 25 de Junho de 2010 Por favor utilize folhas separadas para responder à 1ª e à 2 ª Parte do exame. 1ª Parte 1. É muito frequente determinar-se a concentração proteica de uma determinada solução com base na absorção de luz UV. Diga a que comprimento de onda é que se fazem essas determinações. Refira vantagens e desvantagens desse método. (2.0 val.) 2. Durante as aulas práticas teve a oportunidade de produzir transtirretina utlizando um sistema bacteriano (E. coli). Qual o interesse de produzir proteínas recombinantes neste sistema? Refira vantagens e desvantagens deste sistema. (2.0 val.) 3. Refira dois métodos diferentes para determinar a massa molecular de uma proteína. (1.5 val.) 4. Em que é consiste a técnica de ELISA. Refira as suas aplicações. (1.5 val.) 5. Uma mistura proteica foi analisada por electroforese bidimensional tendo-se obtido o resultado representado a seguir:

10 a. Diga se considera possível separar estas 3 proteínas num só passo. Justifique. (1.0 val.) b. Se respondeu afirmativamente à questão anterior, descreva qual a técnica a usar e refira os seus princípios básicos. Se respondeu negativamente, proponha uma sequência de 2 ou 3 passos que permita o isolamento de cada uma das proteínas e justifique a sua proposta. (2.0 val.) c. Suponha que possui um anticorpo para a proteína que pretende isolar e o resultado do immunoblot revela duas manchas (1 e 3). Como interpreta esse resultado? O que poderia fazer para confirmar a sua interpretação. (2.0 val.) 2ª Parte 6. A cristalização de proteínas pode ser conseguida recorrendo a estratégias de difusão de vapor como é o caso do método da gota suspensa. a. Indique em que se baseia este método e justifique a importância do recurso a um sistema fechado. (2.0 val.) b. Para uma mesma condição, como explica um menor tamanho dos cristais obtidos se o seu número é elevado? (1.0 val.) c. Os resultados finais da cristalografia de raios-x são depositados na base de dados Protein Data Bank. Qual o tipo de informação que aí se encontra e qual o interesse do repositório? (1.0 val.) 7. O fraccionamento celular de um homogeneizado por centrifugação diferencial é um procedimento laboratorial básico. a. Descreva o fundamento deste método de separação e justifique por que se fala apenas do enriquecimento das fracções num dado componente sub-celular. (2.0 val.) b. Para avaliar a qualidade de um fraccionamento celular é usual recorrer-se a enzimas marcadoras. Justifique. (1.0 val.) c. Um investigador segue um determinado protocolo e num dia efectua um fraccionamento usando tubos contendo um dado volume de homogeneizado; alguns dias depois repete o procedimento com sedimentações às mesmas frequências de rotação, mas agora partindo de uma quantidade superior de material biológico e ficando os tubos com maior enchimento. Apenas a quantidade de material foi diferente, sendo que em ambos os casos o enchimento dos tubos foi correcto. Comente. (1.0 val.)

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