Bioquímica. Purificação de proteínas

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1 Bioquímica Purificação de proteínas

2 Estratégia geral - Liberação da proteína do material biológico - Podem ser separados por fracionamento celular - Pode-se separar proteínas por características: Solubilidade Tamanho Carga elétrica Afinidade - Normalmente o primeiro passo de separação da proteína bruta é a adição de sais (sulfato de amônio) ou solventes orgânicos miscíveis com água Separação por diferença de solubilidade

3 Solubilidade da β-lactoglobina em função do ph em diferentes concentrações de NaCl

4 Estratégia geral - Devem-se seguir técnicas para separação parcial ex. Cromatografia Eletroforese - Faz-se importante métodos para detectar e quantificar a proteína de interesse - Por tecnologias de DNA recombinante é possível obter a proteína desejada em maiores quantidades

5 Centrifugação diferencial

6 Densidade e coeficiente de sedimentação

7 Centrifugação por gradiente linear Formação do gradiente de densidade ex. Alta d. 20% sacarose Baixa d. 5% sacarose Pode ser realizada em condições não desnaturante, preservando a estrutura nativa

8 A diálise pode separar moléculas grandes

9 Dextrana Cromatografia de exclusão - filtração em gel

10 Cromatografia de exclusão -filtração em gel

11 Material comumente utilizado na filtração em gel

12 Cromatografia de troca iônica Moléculas com a mesmo sinal de carga da resina selão eluídas primeiramente escolhe-se o ph e a concentração salina desejada

13 Cromatografia de troca iônica

14 Cromatografia por afinidade Muitas proteínas ligam-se específica e não-covalentemente a certas moléculas (enzimas, hormônios, anticorpos) - 1o: ligar a molécula que a proteína tem afinidade a uma matriz insolúvel (ex. Agarose) - 2o: passar a proteína (será adsorvida) - 3o: Eluir a proteína com adição concentrada de ligante

15 High-Pressure Liquid Chromatography

16 High-Pressure Liquid Chromatography

17 High-Pressure Liquid Chromatography (HPLC) Filtração em gel por HPLC define individualmente as proteínas devido sua grade resolução: (1) thyroglobulin (669 kd) (2) catalase (232 kd) (3) bovine serum albumin (67 kd) (4) ovalbumin (43 kd) (5) ribonuclease (13.4 kd)

18 Eletroforese Em um mesmo ph as proteínas apresentarão cargas diferentes A aplicação de um campo elétrico poderá separá-las Uso de um meio sólido: papel ou gel (evita movimentação por convecção)

19 Eletroforese em papel -Aplicação da em tira de papel ou acetato de celulose - As extremidades são imersas em tampão Distintos reservatórios - Aplica-se uma ddp específica - As proteínas migram em direção à carga oposta em velocidades proporcionais às suas cargas - Revelação por coloração específica

20 Eletroforese em papel

21 Eletroforese em gel Muito utilizado para mistura de proteínas ou outras macromoléculas Gel suporte: Agarose ou poliacrilamida Podem ter porosidade variável Separam por carga e por tamanho As proteínas menores migram mais rápido que as maiores, formando bandas Visualização por coloração específica

22 Eletroforese em gel SDS-Page Uso da Poliacrilamida em presença de SDS - O SDS liga-se a radicais hidrofóbicos das proteínas Ocorre a desnaturação - Padrão geral: uma molécula SDS (dodecil sulfato de sódio) a cada dois resíduos de aminoácido - Atribui carga negativa a proteína, mascarando a carga intrínseca da proteína nativa

23 Eletroforese em gel

24 Eletroforese em gel

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27 Eletroforese (SDS-Page) bi-dimensional Separação pelo ponto isoelétrico

28 Eletroforese (SDS-Page) bi-dimensional 1) Separação pelo ponto isoelétrico Baixo ph + Baixo ph + Alto ph _ Alto ph _

29 Eletroforese (SDS-Page) bi-dimensional Proteínas de um mesmo pi são separadas Por seu tamanho Primeira dimensão pi Segunda dimensão tamanho

30 Gel de eletroforese bi-dimensional

31 Análise eletroforese SDS-Page das etapas de purificação de uma proteína

32

33 Determinação da Massa ESPECTROMETRIA DE MASSA COM ELETRONEBULIZAÇÃO - Espectrometria de massa com nebulização: electrospay) - A amostra de proteína em solvente ácido volátil é nebulizada em espectrofotômetro de massa - Na câmara de vácuo As gotículas evaporam deixando as moléculas desnudadas e não fragmentadas de proteínas com múltiplas cargas positivas - As moléculas são aceleradas em campo elétrico e desaceleradas com um campo magnético

34 MALDI-TOF Mass Spectrometry. (1) A amostra de proteína é ionizada (2) Um campo elétrico acelera os íonn para o detector (3) Os íons menores chegam primeiro (4) O pulso do laser de ionização também desencadeia um relógio que mede o tempo da trajetória dos íons (TOF)

35 Espectro de massa (MALDI-TOF) da Insulina e β-lactoglobulina

36 Detecção de proteínas por immunoblotting

37 Como conhecer a estrutura de proteínas Cristalografia de Raios X Imagem da difração de raios X da proteína - É necessário obter o cristal da proteína Técnica conhecida por cristalografia - Inicio com amostra concentrada de proteína - Formação do cristal (por agentes químicos) - No cristal: água reduzida/ moléculas ordenadas CADA PROTEÍNA POSSUÍ UM PADRÃO DE DIFRAÇÃO DE RAIOS X

38 Cristalização da Mioglobina Sulfato de amônio

39 Cristalografia de Raios X

40 Cristal de Mioglobina O salting ou lento favorece a formação de cristais

41 Raio X - Cristal de Mioglobina

42 Seção do mapa de densidade de elétrons da mioglobina

43 Como conhecer a estrutura de proteínas RMN Ressonância Magnética Nuclear A proteína fica em solução A solução é colocada no espectrômetro de ressonância A molécula é colocada sobre um forte campo magnético São aplicados pulsos de radiofrequência que são absorvidos pelos núcleos dos átomos da molécula de proteína exitando-os Quando os núcleos retornam a forma basal, emitem de volta radiofrequências específicas de cada um dos átomos

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