Padronização de imunoblot para diagnóstico sorológico da esquistossomose utilizando antígeno de vermes adultos

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1 Padronização de imunoblot para diagnóstico sorológico da esquistossomose utilizando antígeno de vermes adultos Guedes, PP 1 ; Pinto, PLS 1 e Oliveira, KC 1. 1 Núcleo de Enteroparasitas, Centro de Parasitologia e Micologia, Instituto Adolfo Lutz.

2 O parasita Schistosoma mansoni O parasita Schistosoma mansoni é o causador da esquistossomose. Possui um complexo ciclo biológico, 6 estágios de desenvolvimento, 2 hospedeiros (intermediário e definitivo) Vive nas veias mesentéricas do hospedeiro e o indivíduo infectado libera ovos nas fezes Estima-se que a doença afeta cerca de 200 milhões de indivíduos em 76 países. No Brasil, no ano de 2007 foram confirmados mais de casos da doença Casal de Schistossoma mansoni (Davies laboratory)

3 Métodos diagnósticos para esquistossomose Parasitológico Kato- Katz Hoffman Sorológico Moleculares Elisa Western Blotting PCR PCR Dot Blot Imunofl uorescên cia (RIFI) Convencional Tempo Real

4 Objetivo Padronização de imunoensaios (dot blot e western blot) utilizando antígenos totais extraídos de vermes adultos de S. mansoni para o diagnóstico sorológico da esquistossomose no Núcleo de Enteroparasitas do CPM/IAL.

5 Metodologia: Western Blot 1. Corrida de Eletroforese com gel SDS-Page 8% para separação das proteínas a partir do seu peso molecular. 2. Transferência das proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose. 3. Incubação com o anticorpo primário. 4. Incubação com o anticorpo secundário conjugado com a enzima Peroxidase. 5. Revelação por método colorimétrico (4-cloro-1 naftol).

6 Metodologia: Dot blot Extração de proteinas de vermes adultos Quantificação por Bradford Aplicação dos antígenos sobre a membrana Incubação com anticorpo Anti-IgG Humana conjugado com peroxidase Incubação com Soro do paciente Bloqueio Revelação colorimétrica (4- CN) Todos os experimentos foram realizados com um pool de três soros reativos na RIFI da rotina do núcleo

7 Marcador 1:100 soro 1:500 anti-igg Marcador 1:50 soro 1:100 soro 1:250 soro 1:500 soro 1:50 soro 1:100 soro 1:250 soro 1:500 soro Resultados: Western blot 1:500 anti-igg 1:1000 anti-igg Marcador Page Ruler Prestained Protein (Fermentas) 40ug de extrato total de antígenos em cada poço Pool de 3 soros reativos para RIFI da rotina do NE

8 1:500 soro 1:2500 anti-igg 1:500 soro 1:5000 anti-igg 1:1000 soro 1:2500 anti-igg 1:1000 soro 1:5000 anti-igg Resultados: Dot blot 2,5ug 5ug 10ug 1:500 soro 1:1000 anti-igg 5ug de extrato total de antígeno Para ambas abordagens experimentais foi realizado controle negativo incubando somente o anticorpo secundário na membrana para excluir a possibilidade de inespecificidade do anticorpo.

9 Western blot vs. Dot blot Maior tempo e trabalho para execução Diferencia massa molecular dos antígenos imunogênicos Reconhece sinal específico dos antígenos imunogênicos ( que pode permitir indicar fase de infecção, imunogenicidade estágio-específica, identificar reação cruzada com outros patógenos) Maior simplicidade de execução Menor quantidade de extrato total Incapaz de diferenciar antígenos imunogênicos

10 Conclusões e perspectivas: Foi possível estabelecer as melhores condições de diluição de soro e anticorpo secundário e quantidade de proteína a serem utilizadas em ambas abordagens experimentais. Fomos capazes de detectar sinal de antígenos de baixo e alto peso molecular nos experimentos de WB. Os resultados obtidos até o momento são promissores e esperamos em breve inseri-los na rotina diagnóstica do núcleo. Pretendemos testar os imunoblots com sorotecas de pacientes positivos para esquistossomose e positivos para outras helmintíases para avaliar reação cruzada com outros patógenos Temos a perspectiva de isolar e caracterizar os antígenos imunogênicos por abordagens de proteômica, e tentar estabelecer testes de ELISA a partir dos candidatos identificados.

11 Nossa página na internet: Colaboradores deste trabalho: Dr. Pedro Luis Silva Pinto, diretor do Núcleo de Enteroparasitas Instituto Adolfo Lutz

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