INSTITUTO ADOLFO LUTZ CENTRO DE VIROLOGIA NÚCLEO DE DOENÇAS DE TRANSMISSÃO VETORIAL

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1 INSTITUTO ADOLFO LUTZ CENTRO DE VIROLOGIA NÚCLEO DE DOENÇAS DE TRANSMISSÃO VETORIAL LABORATÓRIO DE RIQUÉTSIAS Fabiana Cristina Pereira dos Santos Pesquisador Científico

2 D) Qual é a previsão para otimizar o diagnóstico da doença?

3 Diagnóstico Laboratorial da Febre Maculosa Brasileira Avanços Desafios

4 - Diagnósticos Clássicos (sorologia, isolamento e IHQ) - FMPCR (qpcr) - Novas perspectivas

5 Rede de Laboratórios de Vigilância Epidemiológica Referência para Febre Maculosa Brasileira Portaria 70/04 Laboratórios de Referência Nacional Fundação Osvaldo Cruz RJ LACEN RIO DE JANEIRO BAHIA GOIÁS Laboratórios de Referência Regional Fundação Ezequiel Dias BH/MG Laboratórios de Referência Regional Instituto Adolfo Lutz LACEN - SP LACEN MINAS GERAIS ESPÍRITO SANTO LACEN PARANA SANTA CATARINA MATO GROSSO DO SUL RIO GRANDE DO SUL

6 Laboratórios de Referência Regional Instituto Adolfo Lutz DOENÇAS RIQUETSIAIS HUMANAS: Febre Maculosa Tifo murino DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO RIFI Febre Q / Endorcardite por Coxiela Erliquioses Bartoneloses Angiomatose Bacilar Doença da Arranhadura do Gato Endocardite por Bartonela (projeto INCOR) DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO Isolamento de Riquétsias do Grupo da Febre Maculosa Diagnóstico Molecular (qpcr)

7 DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DA FEBRE MACULOSA Pesquisa de anticorpos específicos para o Grupo da Febre Maculosa - Reação de Imunofluorescência Indireta em amostras de soro pareadas (intervalo 15 dias) 1: C C C - C - Antígeno Cultura Concentrada de Riquétsias do Grupo Febre Maculosa Anti IgG/M Humano Marcado com Fluoresceína Negativo Positivo Cor e Forma

8 DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DA FEBRE MACULOSA SOROLOGIA: Soro (Tubo seco sem anticoagulante) COLETA: 1ª amostra de soro, colhida na fase aguda da doença 2ª amostra de soro, colhida após 15 dias ESTOCAGEM: É recomendado o congelamento do soro no local da coleta até que seja feita a 2ª coleta para serem encaminhadas juntas. TRANSPORTE : Temperatura 4-6 C (gelox). PEDIDO DO EXAME: Na ficha do SINAN com dados completos

9 A B C D Na figura 1 podemos visualizar a reação de IFI para Grupo Febre Maculosa: A- controle negativo, IgG (10X); B- controle negativo (40X); C- controle positivo,igg (10X); D- controle positivo (40X)

10 Por que colher 2 amostras para sorologia para FM? Perfil da Resposta Imune (FM) Título de Anticorpos (IFI) IgM IgG ª 2ª Associação entre a produção de anticorpos (infecção produtiva) com os sintomas clínicos compatíveis com a FM. O IgG se liga de forma mais específica, diminuindo a probabilidade de falso positivo.

11 Por que colher 2 amostras para sorologia para FM? 1ª amostra 2ª amostra anticorpos específicos estão indetectáveis Falso negativo títulos baixos -reações cruzadas ou inespecíficas - Regiões endêmicas: Cicatriz sorológica de Infecção passada - IgG<64, descarta-se a possibilidade de ser caso de FM. - Elevação de 2 títulos confirma laboratorialmente o caso induz erroneamente à exclusão de outros patógenos causadores de febres hemorrágicas, como dengue e leptospirose. Falso positivo

12 DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO Isolamento em Cultura de Células VERO - shell vial Pérolas de vidro Agitação no vortex 500 µl Centrifugação 2500 rpm 25 C 1 hora Incubação 37 C 5 dias BHI 1mL Coágulo 5mL sangue Positivo focos Negativo Anti IgG Marcado com Fluoresceína Incubar com soro IgG positivo para FM

13 DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO - ISOLAMENTO ISOLAMENTO: Cultura de células: VERO shell vial COLETA: Coleta única, no início dos sintomas, antes da antibioticoterapia ou até 48 horas após a medicação. Flaconete criorresistente estéril com 1 ml de BHI. Não utilizar tubo de vidro! AMOSTRAS: - Coágulo retraído de 5 ml de sangue (separar o soro 1ª amostra) - Fragmento de pele (lesão) ESTOCAGEM: Freezer 70ºC / Nitrogênio líquido TRANSPORTE : Gelo seco Nitrogênio líquido PEDIDO DO EXAME: Na ficha do SINAN com dados completos

14 A B C D E F Fig 2 Isolamento em cultura celular (Vero) seguido por identificação por Imunofluorescência indireta para riquétsias do Grupo da Febre Maculosa: A- controle negativo (10x); B- controle negativo (20x); C- controle negativo (40x); D- isolamento positivo (10x); E- isolamento positivo (20x); F- isolamento positivo (40x); Fonte: Santos et al. Fotomicroscópio Zeiss, modelo Axioskop 2 plus Fotografado por Dra Jussara Bianchi Castelli do Laboratório de Patologia do InCor-HCFMUSP.

15 DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO - ISOLAMENTO Isolamento positivo conclusivo Primeiras evidências de que a sorologia estava falhando em detectar casos fatais positivos Útil em casos mais graves (vasculite) negativo baixo valor preditivo fatores que interferem - Antibióticoterapia prévia - Condições de Esterilidade - Viabilidade da riquétsia Coleta precoce intensa riquetsemia 2ª Amostra RIFI - IgG<64, descarta-se a possibilidade de ser caso de FM. - Elevação de 2 títulos confirma laboratorialmente o caso

16 DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO IHQ RESPONSÁVEL: Dra. Roosecelis A. Brasil Médica Anátomo-patologista do Núcleo de Anatomia Patológica Instituto Adolfo Lutz- Centro de Patologia IMUNOHISTOQUÍMICA: Imunoperoxidase para Rickettsia spp. COLETA: Autópsia, viscerotomia ou lesão de pele com manifestações vasculíticas AMOSTRAS: Fragmento de pele, fígado e pulmão ESTOCAGEM: Acondicionar cada fragmento (1,5cm 3 ) em frasco individual de boca larga TRANSPORTE : Formalina a 10% em temperatura ambiente. Transportar em no máximo 48h PEDIDO DO EXAME: Na ficha do SINAN com dados completos

17 Immunohistochemistry to Rickettsia spp in autopsy specimens Immunohistochemical assay showing granular antigen satining in endothelium (polyclonal anti- Rickettsia antibody- X400) Fonte: Dra. Roosecelis A. Brasil, Centro de Patologia - IAL

18 DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO FMPCR (qpcr) PCR em tempo real para FM (FMPCR): Exame complementar à sorologia, exclusivo para elucidar casos fatais de FM. COLETA, ESTOCAGEM E TRANSPORTE: mesma da sorologia (1ª amostra/fase aguda) AMOSTRA: soro (sangue pós mortem?) volume 250 µl RESULTADO: SIGH desde maio/11

19 DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO - FMPCR PCR é uma reação baseada na replicação do DNA Extração do ácido nucléico através kit comercial (coluna de sílica) O DNA do agente infeccioso é amplificado e o sinal dessa amplificação é captado pelo aparelho (composto fluorescente)

20 DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO - FMPCR O exame FMPCR atualmente é constituído por 3 reações de qpcr: uma para Rickettsia spp (gene glta, com detecção por sonda TaqMan ) um para riquétsias Grupo Febre Maculosa (gene OmpA, com detecção por SYBR Green) um controle interno endógeno (RNAse P humana, com detecção por sonda TaqMan )

21 Curva de eficiência dos ensaios ABI 7500 Rickettsia sp (glta) detecção por probe TaqMan ROCHE Light Cycler II-480 GFM (OmpA) detecção por Sybr Green

22 DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO - FMPCR Grupo Febre Maculosa (OmpA) Rickettsia spp (Citrato Sintase) Controle Interno Endógeno (RNAse P humana) Resultado no Laudo Positivo Positivo Positivo Positivo Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Indeterminado* *indeterminado= qualidade da amostra ou processamento insuficiente para validação do resultado. São raros os resultados positivos em apenas uma região gênica do patógeno (OmpA ou Citrato Sintase), nestes casos a amostra é processada novamente.

23 DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO - FMPCR FMPCR Sorologia RIFI FMPCR Sorologia RIFI FMPCR Bacteremia Período (curto) Intensidade -Sangue -Pós mortem -Tecidos -Coágulo -podem ser utilizados -resistência da matriz Soro -mais frequentemente -Fácil processamento vasculite aguda compatível com casos de óbito qpcr qpcr Gravidade Gravidade 40 casos Não fatais soroconversão 1ª amostra IgG<64 10 positivos 30 negativos Sensibilidade 25% Em casos não fatais

24 AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DA PCR EM TEMPO REAL PARA O DIAGNÓSTICO DA FEBRE MACULOSA BRASILEIRA EM CASOS FATAIS Entre 2010 e 2012 foram selecionados pelo SIGH-IAL, casos fatais que tiveram suspeita clínica e/ou epidemiológica de FMB:

25 Concordância entre os resultados foi de 100% Concordância entre os resultados foi baixa (kappa=0,096, p-valor=0,435, intervalo de confiança 95% de 0,336 a 0,144). RIFI positivo=título de anticorpos tipo IgG e/ou IgM 128

26 31,6% casos como positivos para FMB concordância entre os resultados foi baixa (kappa=0,186, p-valor=0,005, intervalo de confiança 95% de 0,316 a 0,056). FMBPCR foi um avanço o diagnóstico laboratorial da FM

27 FMPCR rotina diagnóstica para casos Fatais (36 casos) 42 (41 casos) a partir de maio até 26 de outubro 23% 28% Fonte: SIGH

28 Novas perspectivas para diagnóstico da FM Aperfeiçoar o ensaio sorológico Projeto do Dr Carlos R. Prudencio: PPSUS: Perfil Antigênico da Resposta Imune Humoral de Patógenos de Interesse em Saúde Pública: Triagem de Antígenos de R. rickettsii por Phage Display Expressão do proteoma de Rickettsia rickettsii objetivando a identificação e caracterização de polipeptídios imunogênicos CNPq: Produção de antígenos recombinantes de Rickettsia rickettsii pela tecnologia de Phage Display submetido para Chamada Nº20/2012 MCTI/CNPq Inovação Tecnológica Antígenos Recombinantes -Sensibilidade -Especificidade ELISA Testes Rápidos - Imunoblots

29 Novas perspectivas para diagnóstico da FM Ampliar as aplicações da FMPCR: Material de escara de inoculação/sufusão hemorrágica FMPCR em horas Swab da lesão (Rayon) Biópsia (punch) Fase inicial da doença Precocemente os casos graves Casos brandos Auxiliar o médico na assistência ao paciente Detectar outras riquétsias menos patogênicas. Separar os casos de FM (Rickettsia rickettsii) De outras riquétsias

30 Novas perspectivas para diagnóstico da FM Ampliar as aplicações da FMPCR: Projeto piloto para avaliar aplicabilidade Dificuldades: Definição dos casos Congestionar o serviço Frequência de escara de inoculação ou máculas Coleta do material Sustento da nova demanda Gastos com exame Recursos humanos (liberação em horas)

31 Nossa Equipe Elvira M.Mendes do Nascimento Pesquisador Científico Fabiana Cristina Pereira dos Santos Pesquisador Científico Sílvia Colombo Assistente Técnica de Apoio à Pesquisa Científica e Tecnológica Nilcéia de Lourdes Ramos Arruda Auxiliar de Laboratório