Diagnóstico de infecções virais

Transcrição

1 Diagnóstico de infecções virais

2 Diagnóstico de infecções virais Duas formas: - buscar o vírus ( ou seus efeitos) ou - buscar a resposta do organismo (especialmente anticorpos)

3 1- na busca do vírus Diagnóstico de viroses Sinais clínicos Detecção do vírus, v antígenos ou genomas Isolamento (+ detecção imunológica gica) Quantificação (contagem de placas,, DICC 50 PCR Hemaglutinação (HA) ELISA Deteção imunológica (IH ou IF) Microscopia eletrônica 50 )

4 Cultivo e identificação de vírus - inoculação em animais - inoculação em ovos embrionados - cultivos celulares - métodos imunoquímicos - microscopia eletrônica

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6 Cultivos celulares - cultivos primários (células diplóides) - linhas celulares (diplóide, 40 passagens ) - células de linhagem (número de passagens indefinido)

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8 CULTIVO DE VÍRUS IN VITRO - Vidro - Plástico - Garrafas Fechadas Ou Abertas (CO 2 ) - Garrafas Estacionárias Ou Rolantes - Tubos de vidro ou plástico - Tubos com lamínulas (tubos de Leighton) - Placas de microtécnica 6, 12, 24, 96 orifícios

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10 EFEITO CITOPÁTICO TICO (ECP): É o dano que o vírus v causa à célula! - lise - arredondamento - vacuolização - formação de sincícios cios - inclusões - picnose - apoptose

11 ME (varredura)

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13 Efeito citopático Herpesvírus rus (coloração por imunoperoxidase)

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15 Efeitos citopaticos (ECP) Controles

16 Coloração do ECP por Hematoxilina-eosina (HE)

17 Detecção de vírus v Células em cultivo Efeito citopático Imunofluorescência (anticorpo marcado)

18 Quantificação de vírus v (formação de placas) placas Contagem de placas (unidades formadoras de placas ou plaque forming unit /ml), ou pfu

19 Quantificação de vírus v Doses infectantes para cultivos celulares (DICC ) DICC 50 = % Dose infectante para 50% dos cultivos celulares

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21 Hemaglutinação (HA) com vírus hemácias se entrelaçam e aderem às paredes Sem vírus Hemácias livres sedimentam

22 Hemaglutinação (HA) Infelizmente, Nem todos os vírus hemaglutinam! Alguns: Influenza ( gripe) Rubéola Parvovírus Coronavírus Vários arbovírus Adenovírus e vários outros Parvo B19 Rubéola Arbovírus

23 Hemaglutinação (HA)

24 Hemaglutinação Diluição Sem vírus prozona título

25 Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA DE CAPTURA) Amostra a ser testada para a detecção de vírus Enzima +Substrato solúvel= cor no líquido vírus Anticorpo Detector Anticorpo de captura

26 Exemplos de ELISAs

27 Imunoperoxidase (IPX) Soro com anticorpos contra o vírus Enzima Anticorpo Detector Substrato insolúvel células coradas Microscópio Células infectadas com vírus

28 Imunoperoxidase (IPX) Material infectado (células ou tecidos) + soro específico (ex: soro humano) + conjugado anti-igg específico (ex. anti-igg humana conjugado à peroxidase) + substrato apropriado ( ex carbazol) = reação colorida

29 Imunoperoxidase Herpesvírus rus (coloração por imunoperoxidase)

30 Imunoperoxidase

31 Imunoperoxidase (IPX) Negativo Positivos

32 Detecção imunológica Imunohistoquímica (IPX) Imunofluorescência Antígenos de herpesvírus em céls. endoteliais Herpesvírus em cultivo celular

33 Imunofluorescência Direta anticorpo marcado sobre material infectado material infectado (suspeito) + anticorpo específico marcado com FITC + luz UV reação colorida

34 Imunofluorescência Indireta Material infectado (células ou tecidos) + soro específico (ex: soro humano) + conjugado anti-igg específico (ex. anti-igg humana/fitc) + luz UV = reação colorida

35 Imunofluorescência- Herpes

36 Western blot (para a detecção de antígenos)

37 ANÁLISES COM ANTICORPOS MONOCLONAIS (Acms) Acms Virus Amostra BD10 2G5 5A5 7F12 11H6 Tipo BHV-1 Colorado - EVI 123/93 - SV BHV-5 V175 (semen) EVI 088/ A N

38 Reação da polimerase em cadeia (PCR) primers DNA viral Primeiro ciclo Segundo ciclo ciclos Milhões de cópias

39 Nódulos linfáticos: HIV Swab cervical: HIV, HPV Sangue total: HIV, CMV Plasma, soro: HIV, HTLV, HCV, HBV Liquido cefalorraquídeo: enterovirus Esputo, saliva, aspirado naso-faríngeo: VRS, Influenza Materia fecal: Rota EXTRAÇÃO DE ACIDOS NUCLEICOS químicos: tiocianato de guanidina proteinase K detergentes físicos: temperatura agitação centrifugação PURIFICAÇÃO lavados ACIDO NUCLEICO DNA ou RNA PRECIPITAÇÃO alcool e sais

40 Amplificação pela reação da polimerase em cadeia (PCR) DNA FITA DUPLA DESNATURAÇÃO 4 PRIMEIROS CICLOS 4 primeiros DA PCR: ciclos fragmento a amplificar HIBRIDIZAÇÃO POLIMERIZAÇÃO 5-3 ADN nº de cadeias duplicadas 4 de comprimento correto: ciclo 1 ciclo 2 ciclo 3 ciclo

41 MODIFICAÇÕES da PCR RT-PCR Nested-PCR Multiplex ADN fs RNA DNA fd RT PCR AAAAA AA ADN fd PCR 1 er par de primers PCR 2 do par de primers ADN fd PCR Possíveis múltiplos pares de primers

42 Gel de PCR (influenza) Gel de ARN Rotavirus

43 Análise do DNA viral com enzimas de restrição Lam SV265 Lam ge ge - 30 A B C D E F G, H, I J K L Kbp M N

44 HERPESVÍRUS RUS RFLP BHV Kb λ 1 5a 5a 1 5a 5a 1 5a 5a 1 5a 5a λ Kb 23,1 23,1 9,4 - RFLP 9,4 6,5 6,5 4,4 4,4 2,3 2,0 2,3 2,0 BamHI BstEII EcoRI HindIII

45 Até aqui, só vimos métodos de detecção do agente! Como podemos detectar anticorpos?

46 2- na busca de anticorpos Diagnóstico de viroses Quando os sinais clínicos jáj passaram Quando houve algum contato com o vírus v Detecção de anticorpos: (usualmente soro ou LCR) Soro-neutraliza neutralização Imunodifusão Inibição da hemaglutinação (IH) Hemaglutinação passiva Imunoperoxidase para anticorpos Imunofluorescência indireta ELISAs (diversos) Western blot outros

47 Diagnóstico sorológico: Porquê amostras de soro pareadas? Nível de Anticorpos 2- na busca dos anticorpos D o e n ç a IgM IgG Anticorpos IgG Dias

48 Detecção de exposição ao vírusv (sorologia) Soro/Vírus rus neutralização Diluir o soro seriadamente: ex: 1/2 1/4 1/8 1/16.1/512 Adicionar volume igual de vírus (100 DICC 50 ) a cada tubo ( ou orifício da placa) Incubar a 37 o C Colocar mistura sobre células Última diluição que evita multiplicação viral é o título -- 1/2 1/4 1/128 1/256 1/512 Sem soro

49 IMUNODIFUSÃO + Soro c/anticorpos anti- H 3 N 2 (reação cruzada parcial Antígeno Soro c/anticorpos ou s/anticorpos Antígenos Identidade

50 IMUNODIFUSÃO Sem identidade Soro controle + +?? Ag + +? Soros em teste Identidade

51 Hemaglutinação (HA) com vírus hemácias se entrelaçam e aderem às paredes Sem vírus Hemácias livres sedimentam

52 Inibição da Hemaglutinação (HI) Ac Inibição da HA (ou IH)

53 Inibição da Hemaglutinação Controle Vírus HA 8 sem 1 sem Diluições do soro 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 Controle negativo

54 Hemaglutinação passiva (Coombs ) Usada para antígenos não hemaglutinantes ou Para anticorpos Antígenos adsorvidos a hemácias

55 AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX Diluente Látex com Ag adsorvido Soro com Acs Lâmina de vidro POSITIVO soro + NEGATIVO soro -

56 Imunoperoxidase para anticorpos (IPX/Ac) Material infectado conhecido (células ou tecidos) + soro suspeito (ex: soro humano) ou LCR, ou outro(?) + conjugado anti-igg específico (ex. anti-igg humana conjugado à peroxidase) + substrato apropriado ( ex carbazol) = reação colorida

57 Imunoperoxidase para anticorpos (IPX/Ac) Soro suspeito +? -? Enzima Anticorpo Detector Substrato insolúvel células coradas Microscópio Células infectadas com vírus

58 ELISA INDIRETO Soro a ser testado para anticorpos Enzima => cor Anticorpo Detector Antígeno aderido à placa

59 ELISA de bloqueio Soro suspeito +? -? onde ligar?? Enzima Anticorpo Detector Substrato solúvel sem cor Microscópio Células infectadas com vírus

60 E E ELISA Indireto 1ª GERAÇÃO Lisado de Virus Ag celular Ac paciente Substrato Cor Ac anti IgG humana Marcada com Enzima E Reações Falso positivas Artrite reumatóide Anti- HLA Não detecta baixos títulos de anticorpos Somente detecta IgG Soporte Solido

61 E E ELISA Indireto 2ª GERAÇÃO Proteinas recombinantes HIV-2 env HIV-1 env HIV-1gag Substrato Cor Ac paciente Ac anti IgG humana E Marcado com Enzima Redução de falsos positivos Detecção de Ac anti HIV-1 e HIV-2 Não detecta baixos títulos de Anticopos Somente detecta IgG HIV-1 env HIV-1 env HIV-2 env HIV-2 env HIV-1 env HIV-1gag HIV-1gag HIV-2 env HIV-1gag Suporte Solido

62 E Substrato ELISA SANDWICH 3ª GERAÇÃO Proteinas recombinantes Peptidos sinteticos HIV-2 env HIV-1 env HIV-1gag Ac paciente E HIV-2 env HIV-1 env HIV-1 pol E Boa especificidade Detecção de Ac anti HIV-1 e HIV-2 HIV-1 pol HIV-2 env HIV-1 env Detecta baixos títulos de Anticorpos Detecta IgG e IgM HIV-1 env HIV-2 env HIV-1 env HIV-1gag HIV-2 env HIV-1gag Suporte Solido

63 ELISA 4ª GERAÇÃO Proteinas recombinantes HIV-2 env HIV-1 env HIV-1gag Peptidos sinteticos HIV-O HIV-2 Substrato Ac paciente Ag viral Ac conjugado E Muito boa especificidade E E Detecta baixos títulos de anticorpos HIV-1 pol HIV-1 env HIV-2 env E HIV-2 env HIV-1 env HIV-1 pol HIV-O HIV-2 E Boa sensibilidade para Ac. anti HIV-2 e Ac anti-grupo M e O de HIV-1 Detecta IgG e IgM Detecta antígenos virais também (HIV-1 y HIV-2) HIV-1 env HIV-2 env HIV-1gag Suporte Solido

64 Imunofluorescência Indireta para a detecção de anticorpos: Material infectado conhecido (células ou tecidos) + soro suspeito (ex: soro humano) + conjugado anti-igg específico (ex. anti-igg humana conjugado à fluoresceína) + luz UV = reação colorida

65 Imunofluorescência Indireta- Herpes Diluições do soro em teste 1:10 1:20 1:40 Titulando um soro com anticorpos

66 TESTES RÁPIDOS

67 Western blot (para a detecção de anticorpos) Western Blot Critérios: WB Positivo: p24,gp41,gp120/160 (pelo menos 2 bandas) WB Negativo: Ausencia total de bandas

68 Limitações da sorologia Detecta exposição, mas não quando ocorreu!!! Para correlação com a doença: Soros pareados IgM Líquido céfalo c raquidiano ela quando ela

69 FIM (POR HOJE!)

70 Vacinas vivas: - com amostras vivas atenuadas ou modificadas - quantidade de vírus pequena - multiplicação no organismo do hospedeiro - número de imunizações menor Vacinas inativadas: - com amostras inativadas ou mortas - quantidade de vírus grande - não se multiplicam no hospedeiro - necessitam adjuvantes - imunizações repetidas

71 Efeito da vacinação e doses de reforço nos níveis n de anticorpos Anticorpos 2 a 3 a 4 a 1 a

72 A presença a de anticorpos indica: - contato prévio com o agente, ou - vacinação

73 Infecções Persistentes - após infecções in útero - vírus não é reconhecido como estranho - hospedeiro dissemina vírus - hospedeiro pode não desenvolver anticorpos

74 O QUE É INFECÇÃO LATENTE? - ocorre nas infecções por herpesvírus rus - vírus aloja-se no gânglio nervoso ou células c do sistema imune - sem lesões aparentes - periodicamente reativado - periodicamente dissemina vírus ao meio ambiente