Isolamento Viral em Cultivo Celular. Adriana Candido Rodrigues

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1 Isolamento Viral em Cultivo Celular Adriana Candido Rodrigues

2 Vírus: Parasitas intracelulares obrigatórios Célula viva para replicação Sistemas Celulares Animais de Laboratório Ovos Embrionados Cultura de Células

3 Importância Animais Cultura Celular Vantagens: Simples Confiável Desvantagens: Tempo Vantagens: Espaço Custo Desvantagem: Menor sensibilidade Sensível Espaço Ética Custo

4 A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. Rapidez no Diagnóstico Viável economicamente. É um método sensível, tendo a capacidade de detectar pequenas concentrações do vírus.

5 Utilidade da cultura celular Diagnóstico e Isolamento Produção de vacinas Biologia molecular do vírus, mecanismo de infecção e patogenia Isolar grande numero de vírus Produção de antígenos virais Realizar testes de neutralização Determinação de concentrações virais

6 N2A Neuroblastoma Murino Origem: American Type Culture Collection, Rockville Md. (ATCC) BHK-21 Rim de Camundongo Recém Nascido Origem: American Type Culture Collection, Rockville Md. (ATCC) Fonte :Instituto Pasteur

7 Vantagens da Célula Universalidade Sensibilidade Custo Espaço Físico Caráter Ético Simplicidade Desvantagens da Célula Contaminação Toxidade

8 1913 Levaditi - primeira descrição Vieuchange et al. Relatou a sensibilidade de culturas celulares primárias de células de rim de camundongo à infecção pelo vírus da raiva. Dois anos mais tarde, Kissling descreveu a passagem seriada de vírus de campo e de cultivo em células primarias de rim de hamster

9 Por volta de 1963, Kissling e Reese demonstraram o potencial da utilização do crescimento viral desta maneira para preparação de uma vacina Larghi et al. - BHK-21 desenvolveram o primeiro isolamento do vírus rábico de rua em células BHK-21 (baby hamster kidney) tendo em vista o seu uso na rotina diagnóstica (CAMPBELL; CHARLTON, 1988).Segundo este experimento: cultura celular apresentou > sensibilidade Smith et al. CER (embrião de galinha). Um ano depois utiliza N2A (neuroblastoma de camundongo)

10 Congelamento Descongelamento Manutenção Fonte: Instituto Pasteur

11 Fonte: Instituto Pasteur A manutenção das células é realizada em dois repiques por semana, efetuados durante sua viabilidade e crescimento.

12 Fonte: Instituto Pasteur Estas células, após crescimento, serão utilizadas na técnica do isolamento viral.

13 Contagem Celular Fonte: Google Obtenção do número de células desejável: 5 x 10 5 células/ml

14 N de células /ml = n total de células X X fator de diluição n de quadrantes N de células encontrado = Volume Final N de células /ml da suspensão original

15 Total de células dos 4 quadrantes x * x 10** 4 * Fator de conversão da câmara de Neubauer **Volume total de meio usadas na suspensão de células. Ex.: 196 x 10 4 x 10 = 490 x 10 4 = 49 x Células/mL 49 x 10 5 Volume final 5 x ml Volume final= 9,8 ml

16

17 Inóculo: Fonte: Instituto Pasteur Uma suspensão a 20% (peso/volume) foi preparada a partir de fragmentos do Sistema Nervoso Central

18 Armazenamento das amostras em freezer Fonte: Instituto Pasteur

19 Após preparar Cabine de Segurança Biológica, homogeneizar a amostra. Manipular no gelo. Fonte: Instituto Pasteur

20 Meio de cultura: para 10 ml de meio acrescentar 30 μl de antibiótico e 30 μl de aminoácidos essenciais Fonte :Instituto Pasteur

21 Adicionar 40μL da amostra em cada orifício da placa, em triplicata. Fonte :Instituto Pasteur

22 Adicionar 160 μl de meio de cultura, homogeneizar. Fonte:Instituto Pasteur

23 Fonte: Instituto Pasteur Adicionar 100 μl de suspensão de células, (contendo 5 x 10 5 células/ml ).

24 Incubar a 37 C em Câmara Úmida de CO2 a 5% de 72 a 96 horas Fonte :Instituto Pasteur

25 Como as células não sofrem efeito citopático, será preciso evidenciar o vírus através da Imunofluorescência Direta (IFD). Remover o sobrenadante com uma bomba de sucção. Fonte :Instituto Pasteur

26 Adicionar 200 μl de Acetona a 80% e incubar por 15 minutos em banho de gelo. Fonte: Instituto Pasteur

27 Após, desprezar Acetona e secar a placa. Fonte: Instituto Pasteur

28 Fonte: Instituto Pasteur Acrescentar 40 μl do conjugado antirrábico, previamente titulado, por orifício, e incubar a 37º C por 60 minutos.

29 Enxaguar a placa por imersão, 3 vezes em solução salina tamponada, ph 7,4, e 3 vezes em água destilada. Secar a placa. Fonte: Instituto Pasteur

30 Fonte: Instituto Pasteur Adicionar 50μL de glicerina tamponada (ph 8.5) em cada orifício

31 Fonte: Instituto Pasteur A leitura será realizada em cada orifício e, sendo observada pelo menos uma célula infectada, será considerada positiva. Orifícios sem células infectadas serão considerados negativos.

32 Positivo Negativo

33 Obrigada! Instituto Pasteur Fonte:Google

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