Anti HBc Ref Controle Negativo

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2 Anti HBc Ref. 414 Sistema para a determinação qualitativa de anticorpos totais contra o antígeno core do vírus da hepatite B (anti-hbc) em soro ou plasma. ELISA - Competição PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM A Solução de Lavagem deve ser diluída 1:10 com água deionizada. Adicionar 50 ml da Solução de Lavagem concentrada (n o 3) a 450 ml de água. Estável 2 semanas entre 2 8 C. Para preparar volumes menores seguir a tabela abaixo: Solução Lavagem Concentrada (ml) Água purificada (ml) PREPARO DA SOLUÇÃO SUBSTRATO-CROMÓGENO (Preparar 10 minutos antes do uso) O reagente Cromógeno (n o 5) congela a temperatura 18 C. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 C) para que descongele completamente e homogeneizar bem antes de usar. Preparar 10 minutos antes do uso. Adicionar 0,28 ml do Cromógeno (n o 5) diretamente no frasco de Tampão Substrato (n o 4) que contém 14 ml e homogeneizar bem. A solução para uso é incolor e deve ser mantida em recipiente vedado e ao abrigo da luz. Descartar caso se torne azul. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo: Tampão Substrato (ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 Cromógeno (ml) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 VALIDAÇÃO DO ENSAIO As absorbâncias devem ser consideradas após subtração do branco de substrato. O não cumprimento de qualquer destes critérios INVALIDA o ensaio analítico. Branco do Substrato Absorbância 0,100 Controle Negativo Cada replicata não deve variar mais que 20% da média das quatro replicatas. A média das absorbâncias deve ser 0,600. Controle Positivo A média das absorbâncias deve ser 0,100 RESULTADOS 1- Calcular a média das absorbâncias do Controle Negativo e do Controle Positivo. Somar as duas médias e multiplicar o resultado por 0,4. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = ( x CN + x CP) X 0,4 2-Dividir a absorbância de cada amostra pelo Cut-off. 3- Resultados: Amostra Relação Absorbância / Cut-off Reativa ou Positiva < 0,90 Não Reativa ou Negativa 1,10 Inconclusiva 0,90 e < 1,10 1

3 Anti HBc PROCEDIMENTO 1 Deixar um poço vazio para o Branco do Substrato. Transferir 0,05 ml do Controle Positivo (2 replicatas), Controle Negativo (4 replicatas) e amostras aos poços 2 correspondentes. 3 Adicionar 0,05 ml de Conjugado (no 2) em todos os poços, exceto ao poço reservado para o Branco de Substrato. 4 Cobrir a placa com uma folha adesiva, agitar delicadamente e incubar a 37 C por 60 minutos. 5 6 Retirar e descartar a folha adesiva. Aspirar o conteúdo dos poços e enchê-los completamente (± 0,350 ml) com a Solução de Lavagem diluída. Repetir o processo de aspiração e lavagem mais 3 vezes, perfazendo um total de 4 ciclos de lavagem. Manter a solução de lavagem nos poços por pelo menos 15 segundos antes de cada ciclo de aspiração. Após a última lavagem, golpear a placa invertida sobre um papel absorvente para eliminar o excesso de líquido Adicionar 0,1 ml da Solução Substrato-Cromógeno diluída em todos os poços, inclusive no poço reservado ao Branco de Substrato. 7 Incubar 30 minutos à temperatura ambiente (20-25 ºC) e ao abrigo da luz. Adicionar 0,1 ml da Solução de Parada (n 8 o 8) a todos os poços, respeitando a mesma sequência e os mesmos intervalos de tempo da adição da solução Substrato-Cromógeno. 9 Ajustar o zero da leitora com o poço reservado ao Branco de Substrato em 450 nm e medir a absorbância em cada um dos poços no prazo máximo de 30 minutos. Recomenda-se realizar leitura bicromática utilizando filtro secundário de nm. ORIENTAÇÕES Ler as instruções de uso do produto. Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente (20-25 C) antes de iniciar o ensaio. Os reagentes líquidos devem ser homogeneizados suavemente antes do uso. Realizar as leituras no prazo máximo de 30 minutos após a adição da Solução Substrato-Cromógeno. Caso a leitora não permita o ajuste do zero com o Branco do Substrato, é necessário subtrair seu valor das absorbâncias das amostras e controles. 2

4 Anti HBc IgM Ref. 415 Sistema para a determinação qualitativa de anticorpos IgM contra o antígeno core do vírus da hepatite B (anti-hbc IgM) em soro ou plasma. ELISA Imunocaptura PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM A Solução de Lavagem Concentrada (n o 5) deve ser diluída 1:25 com água deionizada. Adicionar 40 ml da Solução de Lavagem Concentrada a 960 ml de água. Estável 1 semana entre 2 8 C. Para preparar volumes menores seguir a tabela abaixo: Solução Lavagem Concentrada (ml) Água purificada (ml) PREPARO DO CONJUGADO (Preparar no momento do Uso) O Conjugado Concentrado (n o 2) deve ser diluído 1:50 com o Diluente do Conjugado (n o 3). Adicionar 0,24 ml do Conjugado Concentrado a 11,76 ml do Diluente de Conjugado. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo: Diluente Conjugado (ml) 0,98 1,96 2,94 3,92 4,90 5,88 6,86 7,84 8,82 9,80 10,78 Conjugado Concentrado (ml) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 DILUIÇÃO DAS AMOSTRAS As amostras devem ser diluídas 1/4000 antes de iniciar o ensaio. Colocar 0,99 ml de Diluente de Amostras (n o 4) em um tubo. Adicionar 0,01 ml de amostra e homogeneizar bem. Em outro tubo adicionar 0,39 ml de Diluente de Amostras (n o 4). Adicionar 0,01 ml da diluição do 1º tubo. Homogeneizar bem. O fator de diluição no 2º tubo será 1/4000. NÃO DILUIR O CALIBRADOR E OS CONTROLES. ELES ESTÃO PRONTOS PARA USO. VALIDAÇÃO DO ENSAIO As absorbâncias devem ser consideradas após subtração do branco de substrato. O não cumprimento de qualquer destes critérios INVALIDA o ensaio analítico. Branco do substrato Absorbância 0,150 A absorbância de cada replicata deve ser < 0,120. Se uma replicata se encontrar fora deste intervalo, deve-se descartá-la e calcular Calibrador a média com os outros 2 valores. Se 2 replicatas se encontrarem fora deste intervalo, o teste deve ser repetido. A média das absorbâncias deve ser < 0,120. Controle Negativo Absorbância < 0,120 Controle Positivo Absorbância entre 0,500 e 2,500 C. Positivo C. Negativo > 0,450 RESULTADOS 1- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador e somar 0,200. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x Calibrador + 0,200 2-Dividir a absorbância de cada amostra pelo Cut-off. 3- Resultados: Amostra Relação Absorbância / Cut-off Reativa ou Positiva 1,10 Não Reativa ou Negativa < 0,90 Inconclusiva 0,90 e < 1,10

5 Anti HBc IgM PROCEDIMENTO 1 Deixar um poço vazio para o Branco do Substrato. Adicionar 0,1 ml do Controle Positivo e Controle Negativo (1 replicata de cada), Calibrador (3 replicatas) e 2 as amostras diluídas aos poços correspondentes. O Calibrador e os Controles estão prontos para uso. 3 Cobrir a placa com uma folha adesiva, agitar delicadamente e incubar a 37 C por 120 minutos. Retirar e descartar a folha adesiva. Aspirar o conteúdo dos poços e enchê-los completamente (± 0,350 ml) com a Solução de Lavagem diluída. Repetir o processo de aspiração e lavagem mais 4 vezes, perfazendo um total de 5 ciclos de lavagem. 4 Manter a solução de lavagem nos poços por pelo menos 30 segundos antes de cada ciclo de aspiração. Após a última lavagem, golpear a placa invertida sobre um papel absorvente para eliminar o excesso de líquido. Adicionar 0,1 ml do Conjugado diluído a cada poço, exceto ao poço reservado ao Branco de Substrato. 5 Evitar a formação de bolhas. 6 Cobrir a placa com uma nova folha adesiva e incubar 60 minutos à 37 ºC. 7 Ao final da incubação, retirar a folha adesiva. Aspirar e lavar a placa como no passo 4. Adicionar 0,1 ml da Solução Substrato-Cromógeno (n 8 o 6) em todos os poços, inclusive no poço reservado para o Branco de Substrato. 9 Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente ( 20 a 25 C) e ao abrigo da luz. Parar a reação adicionando 0,1 ml da Solução de Parada (n 10 o 10) em cada poço, respeitando a mesma sequencia e intervalos de tempo observados na adição da Solução Substrato-Cromógeno. 11 Ajustar o zero da leitora com o poço reservado ao Branco de Substrato em 450 nm e medir a absorbância em cada um dos poços no prazo máximo de 30 minutos. Recomenda-se realizar leitura bicromática utilizando filtro secundário de nm. ORIENTAÇÕES Ler as instruções de uso do produto. Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente (20-25 C) antes de iniciar o ensaio. Os reagentes líquidos devem ser homogeneizados suavemente antes do uso. Realizar as leituras no prazo máximo de 30 minutos após a adição da Solução Substrato-Cromógeno. Caso a leitora não permita o ajuste do zero com o Branco do Substrato, é necessário subtrair seu valor das absorbâncias das amostras e controles.

6 Anti HBe Ref. 417 Sistema para a determinação qualitativa de anticorpos específicos contra o antígeno e do vírus da hepatite B (anti-hbe) em soro ou plasma. ELISA - Competição PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM A Solução de Lavagem Concentrada (n o 6) deve ser diluída 1:25 com água deionizada. Adicionar 40 ml da Solução de Lavagem Concentrada a 960 ml de água. Estável 1 semana entre 2-8 C. Para preparar volumes menores seguir a tabela abaixo: Solução Lavagem Concentrada (ml) Água purificada (ml) PREPARO DO CONJUGADO (Preparar no momento do Uso) O Conjugado Concentrado (n o 2) deve ser diluído 1:50 com o Diluente do Conjugado (n o 3). Adicionar 0,24 ml do Conjugado Concentrado a 11,76 ml do Diluente de Conjugado. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo: Diluente Conjugado (ml) 0,98 1,96 2,94 3,92 4,90 5,88 6,86 7,84 8,82 9,80 10,78 Conjugado Concentrado (ml) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 VALIDAÇÃO DO ENSAIO As absorbâncias devem ser consideradas após subtração do branco de substrato. O não cumprimento de qualquer destes critérios INVALIDA o ensaio analítico. Branco do substrato Absorbância 0,150 A absorbância de cada replicata deve estar entre 0,500 e 2,500. Calibrador Se uma replicata se encontrar fora deste intervalo, deve-se descartá-la e calcular a média com os outros 2 valores. Se 2 replicatas se encontrarem fora deste intervalo, o teste deve ser repetido. Controle Negativo Absorbância entre 0,500 e 2,500. Controle Positivo Absorbância entre 0,050 e 0,300. C. Negativo C. Positivo > 0,250 RESULTADOS 1- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador e multiplicar por 0,5. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x Calibrador x 0,5 2-Dividir a absorbância de cada amostra pelo Cut-off. 3- Resultados: Amostra Relação Absorbância / Cut-off Reativa ou Positiva < 0,90 Não Reativa ou Negativa 1,10 Inconclusiva 0,90 e < 1,10

7 Anti HBe PROCEDIMENTO 1 Deixar um poço vazio para o Branco do Substrato. Transferir 0,05 ml do de Tampão de Incubação (n 2 o 4) a todos os poços, exceto ao poço reservado ao Branco de Substrato. Adicionar 0,05 ml do Controle Positivo e Controle Negativo (1 replicata de cada), Calibrador (3 replicatas) e 3 amostras aos poços correspondentes. Adicionar 0,05 ml de Solução Neutralizante (n 4 o 5) a todos os poços, exceto ao poço reservado ao Branco do Substrato. 5 Cobrir a placa com uma folha adesiva, agitar delicadamente e incubar a 37 C por 120 minutos. Retirar e descartar a folha adesiva. Aspirar o conteúdo dos poços e enchê-los completamente (± 0,350 ml) com a Solução de Lavagem diluída. Repetir o processo de aspiração e lavagem mais 4 vezes, perfazendo um total de 5 ciclos de lavagem. 6 Manter a solução de lavagem nos poços por pelo menos 30 segundos antes de cada ciclo de aspiração. Após a última lavagem, golpear a placa invertida sobre um papel absorvente para eliminar o excesso de líquido. Adicionar 0,1 ml do Conjugado diluído a cada poço, exceto ao poço reservado ao Branco do Substrato. 7 Evitar a formação de bolhas. 8 Cobrir a placa com uma nova folha adesiva e incubar 60 minutos à 37 ºC. 9 Ao final da incubação, retirar a folha adesiva. Aspirar e lavar a placa como no passo Adicionar 0,1 ml da Solução Substrato-Cromógeno (n o 7) em todos os poços, inclusive no poço reservado para o Branco de Substrato. 11 Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente ( 20 a 25 C) e ao abrigo da luz Parar a reação adicionando 0,1 ml da Solução de Parada (n o 11) em cada poço, respeitando a mesma sequencia e intervalos de tempo observados na adição da Solução Substrato-Cromógeno. Ajustar o zero da leitora com o poço reservado ao Branco de Substrato em 450 nm e medir a absorbância em cada um dos poços no prazo máximo de 30 minutos. Recomenda-se realizar leitura bicromática utilizando filtro secundário de nm. ORIENTAÇÕES Ler as instruções de uso do produto. Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente (20-25 C) antes de iniciar o ensaio. Os reagentes líquidos devem ser homogeneizados suavemente antes do uso. Realizar as leituras no prazo máximo de 30 minutos após a adição da Solução Substrato-Cromógeno. Caso a leitora não permita o ajuste do zero com o Branco do Substrato, é necessário subtrair seu valor das absorbâncias das amostras e controles.

8 Anti HBs Ref. 413 Sistema para a determinação qualitativa e quantitativa de anticorpos específicos contra o antígeno de superfície do vírus da hepatite B (anti-hbs) em soro ou plasma. ELISA Sanduíche (Ag-Ac-Ag) PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM A Solução de Lavagem Concentrada (n o 3) deve ser diluída 1:10 com água deionizada. Adicionar 50 ml da Solução de Lavagem Concentrada a 450 ml de água. Estável 2 semanas entre 2 8 C. Para preparar volumes menores seguir a tabela abaixo: Solução Lavagem Concentrada (ml) Água purificada (ml) PREPARO DA SOLUÇÃO SUBSTRATO-CROMÓGENO (Preparar 10 minutos antes do Uso) O reagente Cromógeno (n o 5) congela a temperatura 18 C. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 C) para que descongele completamente e homogeneizar bem antes de usar. Adicionar 0,28 ml do Cromógeno (n o 5) diretamente ao frasco de Tampão Substrato (n o 4) que contém 14 ml e homogeneizar bem. A solução para uso é rósea e deve ser mantida em recipiente vedado e ao abrigo da luz. Descartar caso se torne azul. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo: Tampão Substrato (ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 Cromógeno (ml) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 VALIDAÇÃO DO ENSAIO (O ensaio será considerado válido apenas se cumprir os critérios abaixo): As absorbâncias devem ser consideradas após subtração do branco de substrato. O não cumprimento de qualquer destes critérios INVALIDA o ensaio analítico. Branco do Substrato Absorbância 0,100 Controle Negativo Absorbância < 0,100 Absorbância > 0,070 Calibrador Positivo Baixo Deve também ser maior que o dobro da média do Controle Negativo. Calibrador Positivo Alto Absorbância entre 0,800 e 2,100 RESULTADOS QUALITATIVOS 1- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador Positivo Baixo. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = média Calibrador Positivo Baixo 2-Dividir a absorbância de cada amostra pelo Cut-off. 3- Resultados: Amostra Relação Absorbância / Cut-off Reativa ou Positiva 1,10 Não Reativa ou Negativa < 0,90 Inconclusiva 0,90 e < 1,10 RESULTADOS QUANTITATIVOS 1- Calcular a média das absorbâncias do Controle Negativo. A concentração de anti-hbs é Zero. 2- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador Positivo Baixo. A concentração de anti-hbs é de 10 mui/ml. 3- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador Positivo Alto. A concentração de anti-hbs é de 100 mui/ml. 4- Representar em uma folha de papel milimetrado, as médias das absorbâncias dos calibradores e controle na ordenada (eixo y) contra suas respectivas concentrações em mui/ml na abscissa (eixo x). 5- Traçar uma linha passando pelos 3 pontos. 6- Utilizando o gráfico é possível encontrar as concentrações das amostras a partir de suas absorbâncias. Para facilitar os cálculos, utilizar a planilha: anti-hbs RESULTADOS QUANTITATIVOS, disponível em

9 Anti HBs PROCEDIMENTO 1 Deixar um poço vazio para o Branco do Substrato. Transferir 0,1 ml do Controle Negativo, Calibrador Positivo Baixo, Calibrador Positivo Alto (2 replicatas de 2 cada) e amostras aos poços correspondentes. 3 Cobrir a placa com uma folha adesiva, agitar delicadamente e incubar a 37 C por 60 minutos. Retirar e descartar a folha adesiva. Aspirar o conteúdo dos poços e enchê-los completamente (± 0,350 ml) com a Solução de Lavagem diluída. Repetir o processo de aspiração e lavagem mais 3 vezes, perfazendo um total de 4 ciclos de lavagem. 4 Manter a solução de lavagem nos poços por pelo menos 15 segundos antes de cada ciclo de aspiração. Após a última lavagem, golpear a placa invertida sobre um papel absorvente para eliminar o excesso de líquido. Adicionar 0,1 ml do Conjugado (n 5 o 2) em todos os poços, exceto ao poço reservado ao Branco de Substrato. 6 Cobrir a placa com uma folha adesiva e incubar a 37 C por 30 minutos. Adicionar 0,1 ml da Solução Substrato-Cromógeno diluída em todos os poços, inclusive no poço 7 reservado ao Branco de Substrato. 8 Incubar 30 minutos à temperatura ambiente (20-25 ºC) e ao abrigo da luz. Adicionar 0,1 ml da Solução de Parada (n 9 o 9) a todos os poços, respeitando a mesma sequência e os mesmos intervalos de tempo da adição da solução Substrato-Cromógeno. Ajustar o zero da leitora com o poço reservado ao Branco de Substrato em 450 nm e medir a absorbância 10 em cada um dos poços no prazo máximo de 30 minutos. Recomenda-se realizar leitura bicromática utilizando filtro secundário de nm. ORIENTAÇÕES Ler as instruções de uso do produto. Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente (20-25 C) antes de iniciar o ensaio. Os reagentes líquidos devem ser homogeneizados suavemente antes do uso. Realizar as leituras no prazo máximo de 30 minutos após a adição da Solução Substrato-Cromógeno. Caso a leitora não permita o ajuste do zero com o Branco do Substrato, é necessário subtrair seu valor das absorbâncias das amostras e controles.

10 CHAGAS Ref. 421 Sistema para a determinação qualitativa de anticorpos totais específicos anti-trypanosoma cruzi em soro ou plasma. ELISA Indireto (Ag-Ac-Ac) PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM A Solução de Lavagem Concentrada deve ser diluída 1:10 com água deionizada. Adicionar 50 ml da Solução de Lavagem concentrada (n o 5) a 450 ml de água. Estável 2 semanas entre 2 8 C. Para preparar volumes menores seguir a tabela abaixo: Solução Lavagem Concentrada (ml) Água purificada (ml) PREPARO DO CONJUGADO (Preparar no momento do uso) O Conjugado Concentrado (n o 2) deve ser diluído 1:51 com o Diluente do Conjugado (n o 3). Adicionar 3,0 ml de Conjugado Concentrado ao frasco que contém 15 ml de Diluente de Conjugado e homogeneizar suavemente. Preparar no momento do uso. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo: Diluente de Conjugado (ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 Conjugado Concentrado (ml) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 PREPARO DA SOLUÇÃO SUBSTRATO-CROMÓGENO (Preparar 10 minutos antes do Uso) O reagente Cromógeno (n o 7) congela a temperatura 18 C. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 C) para que descongele completamente e homogeneizar bem antes de usar. Preparar 10 minutos antes do uso. Adicionar 0,28 ml do Cromógeno (n o 7) diretamente no frasco de Tampão Substrato (n o 4) que contem 14 ml e homogeneizar bem. A solução para uso é incolor e deve ser mantida em recipiente vedado e ao abrigo da luz. Descartar caso se torne azul. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo: Tampão Substrato (ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 Cromógeno (ml) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 VALIDAÇÃO DO ENSAIO As absorbâncias devem ser consideradas após subtração do branco de substrato. O não cumprimento de qualquer destes critérios INVALIDA o ensaio analítico. Branco do Substrato Absorbância 0,100 A absorbância de cada replicata deve ser 0,200. Se uma replicata se encontrar fora Controle Negativo dessa margem, deve-se descartá-la e calcular a média com os outros 2 valores. Se 2 replicatas se encontrarem fora dessa margem, o teste deverá ser repetido. Controle Positivo A média das absorbâncias deve ser 0,600 RESULTADOS 1- Calcular a média das absorbâncias do Controle Negativo e somar 0,300. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x CN + 0,300 2-Dividir a absorbância de cada amostra pelo Cut-off. 3- Resultados: Amostra Relação Absorbância / Cut-off Reativa ou Positiva 1,10 Não Reativa ou Negativa < 0,90 Inconclusiva 0,90 e < 1,10

11 CHAGAS PROCEDIMENTO 1 Deixar um poço vazio para o Branco do Substrato. Transferir 0,2 ml do Controle Positivo (2 replicatas) e Controle Negativo (3 replicatas) aos poços 2 correspondentes. Não diluir os controles, pois estão prontos para uso. Adicionar 0,2 ml de Diluente de Amostras (n 3 o 4) aos poços correspondentes. Adicionar 0,01 ml de amostra em cada poço de amostra. 4 Cobrir a placa com uma folha adesiva e incubar a 37 C por 60 minutos. Retirar e descartar a folha adesiva. Aspirar o conteúdo dos poços e enchê-los completamente (± 0,350 ml) com a Solução de Lavagem diluída. Repetir o processo de aspiração e lavagem mais 3 vezes, perfazendo um total de 4 ciclos de lavagem. 5 Manter a solução de lavagem nos poços por pelo menos 15 segundos antes de cada ciclo de aspiração. Após a última lavagem, golpear a placa invertida sobre um papel absorvente para eliminar o excesso de líquido Adicionar 0,1 ml do Conjugado diluído em todos os poços, exceto ao poço reservado ao Branco de 6 Substrato. Evitar a formação de bolhas. 7 Cobrir a placa com uma nova folha adesiva e incubar a 37 ºC por 30 minutos. 8 Ao final da incubação retirar a folha adesiva. Aspirar e lavar a placa como no passo 5. 9 Adicionar 0,1 ml da Solução substrato-cromógeno diluído em todos os poços, inclusive no poço reservado ao Branco de Substrato. 10 Incubar 30 minutos à temperatura ambiente (20 a 25 C) e ao abrigo da luz. 11 Adicionar 0,1 ml da Solução de Parada (no 10) a todos os poços, respeitando a mesma sequência e intervalos de tempo da adição da solução Substrato-Cromógeno. 12 Ajustar o zero da leitora com o poço reservado ao Branco de Substrato em 450 nm e medir a absorbância em cada um dos poços no prazo máximo de 30 minutos. Recomenda-se realizar leitura bicromática utilizando filtro secundário de nm. ORIENTAÇÕES Ler as instruções de uso do produto. Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente (20-25 C) antes de iniciar o ensaio. Os reagentes líquidos devem ser homogeneizados suavemente antes do uso. Realizar as leituras no prazo máximo de 30 minutos após a adição da Solução Substrato-Cromógeno. Caso a leitora não permita o ajuste do zero com o Branco do Substrato, é necessário subtrair seu valor das absorbâncias das amostras e controles.

12 CMV IgG Ref. 406 Sistema para a determinação qualitativa e quantitativa de anticorpos IgG específicos anti-cmv em soro ou plasma. ELISA Indireto (Ag-Ac-Ac) PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM A Solução de Lavagem deve ser diluída 1:10 com água deionizada. Adicionar 50 ml da Solução de Lavagem concentrada (n o 5) a 450 ml de água. Estável 2 semanas entre 2 8 C. Para preparar volumes menores seguir a tabela abaixo: Solução Lavagem Concentrada (ml) Água purificada (ml) DILUIÇÃO DO CONJUGADO CONCENTRADO (Preparar no momento do Uso) Diluir o Conjugado Concentrado (n o 2) 1/51 com o Diluente do Conjugado (n o 3). Adicionar 0,3 ml de Conjugado Concentrado ao frasco que contém 15 ml de Diluente do Conjugado. Homogeneizar suavemente. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo: 2 Diluente do Conjugado (ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 Conjugado Concentrado (ml) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 PREPARO DA SOLUÇÃO SUBSTRATO-CROMÓGENO (Preparar 10 minutos antes do Uso) O reagente Cromógeno (n o 7) congela a temperatura 18 C. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 C) para que descongele completamente e homogeneizar bem antes de usar. Adicionar 0,28 ml do Cromógeno (n o 7) diretamente no frasco de Tampão Substrato (n o 6) que contém 14 ml e homogeneizar bem. Preparar 10 minutos antes do Uso. A solução para uso é incolor e deve ser mantida em recipiente vedado e ao abrigo da luz. Descartar caso se torne azul. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo: Tampão Substrato (ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 Cromógeno (ml) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 DILUIÇÃO DAS AMOSTRAS Preparar diluições 1/101 dos Calibradores (n o 8 e 9), Controle Negativo (n o 10) e amostras. Exemplo: Pipetar 1,0 ml do Diluente de Amostras (n o 4) em um tubo e adicionar 0,01 ml de soro. Homogeneizar suavemente. ORIENTAÇÕES Ler as instruções de uso do produto. Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente (20-25 C) antes de iniciar o ensaio. Os reagentes líquidos devem ser homogeneizados suavemente antes do uso. Realizar as leituras no prazo máximo de 30 minutos após a adição da Solução Substrato-Cromógeno. Caso a leitora não permita o ajuste do zero com o Branco do Substrato, é necessário subtrair seu valor das absorbâncias das amostras e controles.

13 CMV IgG VALIDAÇÃO DO ENSAIO As absorbâncias devem ser consideradas após subtração do branco de substrato. O não cumprimento de qualquer destes critérios INVALIDA o ensaio analítico. Branco do substrato Absorbância 0,100 Controle Negativo Absorbância < 0,100 Calibrador Positivo Baixo Absorbância 0,150 Calibrador Positivo Alto Absorbância 0,600 Relação Calibrador Positivo Alto / Calibrador Positivo Baixo 2,0 Relação Controle Negativo / Calibrador Positivo baixo 0,5 RESULTADOS QUALITATIVOS 1- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador Positivo Baixo. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x Calibrador Positivo Baixo 2-Dividir a absorbância de cada amostra pelo Cut-off. 3- Resultados: Amostra Relação Absorbância / Cut-off Reativa ou Positiva 1,10 Não Reativa ou Negativa < 0,90 Inconclusiva 0,90 e < 1,10 RESULTADOS QUANTITATIVOS 1- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador Positivo Baixo. A concentração de IgG anti-cmv é de 0,25 UI/mL. 2- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador Positivo Alto. A concentração de IgG anti-cmv é de 2,5 UI/mL. 3- Representar em folha de papel semi-logaritmico, as médias das absorbâncias dos calibradores na ordenada (eixo y, linear), contra suas respectivas concentrações em UI/mL na abscissa (eixo x, log). 4- traçar uma linha passando pelos 2 pontos. 5- Utilizando o gráfico é possível encontrar as concentrações das amostras a partir de sua absorbância. Para facilitar os cálculos dos resultados quantitativos, utilizar planilha: CMV IgG RESULTADOS QUANTITATIVOS, disponível em

14 CMV IgG PROCEDIMENTO 1 Deixar um poço vazio para o Branco do Substrato. Transferir 0,1 ml do Calibrador Positivo Baixo, Calibrador Positivo Alto e Controle Negativo (2 replicatas de 2 cada) e amostras aos poços correspondentes. Diluir Calibradores, Controle e amostras conforme orientação. 3 Cobrir a placa com uma folha adesiva e incubar a 37 C por 60 minutos. 4 5 Retirar e descartar a folha adesiva. Aspirar o conteúdo dos poços e enchê-los completamente (± 0,350 ml) com a Solução de Lavagem diluída. Repetir o processo de aspiração e lavagem mais 3 vezes, perfazendo um total de 4 ciclos de lavagem. Manter a solução de lavagem nos poços por pelo menos 15 segundos antes de cada ciclo de aspiração. Após a última lavagem, golpear a placa invertida sobre um papel absorvente para eliminar o excesso de líquido. Adicionar 0,1 ml do Conjugado diluído em todos os poços, exceto no poço reservado ao Branco de Substrato. Evitar a formação de bolhas. 6 Cobrir a placa com uma nova folha adesiva e incubar a 37 C por 30 minutos. 7 Ao final da incubação retirar a folha adesiva. Aspirar e lavar a placa como no passo 4. Adicionar 0,1 ml da Solução Substrato-Cromógeno diluída em todos os poços, inclusive no poço 8 reservado ao Branco de Substrato. 9 Incubar 30 minutos à temperatura ambiente (20-25 ºC) e ao abrigo da luz. Adicionar 0,1 ml da Solução de Parada (n 10 o 11) a todos os poços, respeitando a mesma sequência e os mesmos intervalos de tempo da adição da solução Substrato-Cromógeno. 11 Ajustar o zero da leitora com o poço reservado ao Branco de Substrato em 450 nm e medir a absorbância em cada um dos poços no prazo máximo de 30 minutos. Recomenda-se realizar leitura bicromática utilizando filtro secundário de nm.

15 CMV IgM Ref. 407 Sistema para a determinação qualitativa e semi-quantitativa de anticorpos IgM específicos anti-cmv em soro ou plasma. ELISA Sanduíche-Imunocaptura (Ac-Ac-Ag) PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM A Solução de Lavagem deve ser diluída 1:10 com água deionizada. Adicionar 50 ml da Solução de Lavagem concentrada (n o 5) a 450 ml de água. Estável 2 semanas entre 2 8 C. Para preparar volumes menores seguir a tabela abaixo: Solução Lavagem Concentrada (ml) Água purificada (ml) DILUIÇÃO DO CONJUGADO CONCENTRADO E CONTROLE DE ANTÍGENO (Preparar no momento do Uso) Diluir o Conjugado Concentrado (n o 2) e o Controle de Antígeno (n o 3) 1/101 com o Tampão Diluente (n o 4). Adicionar 0,12 ml de Conjugado Concentrado mais 0,12 ml do Controle de Antígeno e 12 ml do Tampão Diluente. Homogeneizar suavemente. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo: Tampão Diluente (ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 Conjugado Concentrado (ml) 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 0,12 Controle de Antígeno (ml) 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 0,12 PREPARO DA SOLUÇÃO SUBSTRATO-CROMÓGENO (Preparar 10 minutos antes do Uso) O reagente Cromógeno (n o 7) congela a temperatura 18 C. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 C) para que descongele completamente e homogeneizar bem antes de usar. Adicionar 1,2 ml do Cromógeno (n o 7) a 10,8 ml do Tampão Substrato (n o 6). Homogeneizar bem. A solução para uso é incolor e deve ser mantida em recipiente vedado e ao abrigo da luz. Descartar caso se torne azul. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo: Tampão Substrato (ml) 0,9 1,8 2,7 3,6 4,5 5,4 6,3 7,2 8,1 9,0 9,9 Cromógeno (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 DILUIÇÃO DAS AMOSTRAS Preparar diluições 1/101 das amostras. Exemplo: Em um tubo pipetar 1,0 ml do Tampão Diluente (n o 4) e adicionar 0,01 ml da amostra. Homogeneizar suavemente. Não diluir os Controles (n o 8, 9 e 10) pois estão prontos para uso. ORIENTAÇÕES Ler as instruções de uso do produto. Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente (20-25 C) antes de iniciar o ensaio. Os reagentes líquidos devem ser homogeneizados suavemente antes do uso. Realizar as leituras no prazo máximo de 30 minutos após a adição da Solução Substrato-Cromógeno. Caso a leitora não permita o ajuste do zero com o Branco do Substrato, é necessário subtrair seu valor das absorbâncias das amostras e controles.

16 CMV IgM VALIDAÇÃO DO ENSAIO As absorbâncias devem ser consideradas após subtração do branco de substrato. O não cumprimento de qualquer destes critérios INVALIDA o ensaio analítico. Branco do substrato Absorbância 0,100 A absorbância de cada replicata não deve variar Controle Positivo Baixo mais do que 25% em relação à média das 4 absorbâncias. A média deve ser entre 0,200 e 0,600. Relação Controle Positivo Alto/Controle Positivo Baixo > 3,0 Relação Controle Negativo/Controle Positivo Baixo < 0,7 RESULTADOS QUALITATIVOS 1- Calcular a média das absorbâncias do Controle Positivo Baixo. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x Controle Positivo Baixo 2-Dividir a absorbância de cada amostra pelo Cut-off. 3- Resultados: Amostra Relação Absorbância / Cut-off Reativa ou Positiva 1,10 Não Reativa ou Negativa < 0,90 Inconclusiva 0,90 e < 1,10 RESULTADOS SEMI-QUANTITATIVOS 1- Calcular o valor do Cut-off como descrito anteriormente. 2- Calcular a concentração das IgM em Unidades Arbitrárias (UA/mL) dividindo a absorbância da amostra pelo valor do Cut-off e multiplicando o resultado por 10. UA/mL = absorbância da amostra / Cut-off x Resultados: Amostra Relação Absorbância / Cut-off Reativa ou Positiva 11 Não Reativa ou Negativa < 9 Inconclusiva 9 e < 11

17 CMV IgM PROCEDIMENTO 1 Deixar um poço vazio para o Branco do Substrato. Transferir 0,1 ml do Controle Positivo Alto, Controle Negativo (2 replicatas de cada), Controle Positivo 2 Baixo (4 replicatas) e amostras diluídas aos poços correspondentes. 3 Cobrir a placa com uma folha adesiva e incubar a 37 C por 60 minutos. Retirar e descartar a folha adesiva. Aspirar o conteúdo dos poços e enchê-los completamente (± 0,350 ml) com a Solução de Lavagem diluída. Repetir o processo de aspiração e lavagem mais 4 vezes, perfazendo um total de 5 ciclos de lavagem. 4 Manter a solução de lavagem nos poços por pelo menos 15 segundos antes de cada ciclo de aspiração. Após a última lavagem, golpear a placa invertida sobre um papel absorvente para eliminar o excesso de líquido. Adicionar 0,1 ml do Conjugado diluído em todos os poços, exceto no poço reservado ao Branco de 5 Substrato. Evitar a formação de bolhas. 6 Cobrir a placa com uma nova folha adesiva e incubar a 37 C por 60 minutos. 7 Ao final da incubação, retirar a folha adesiva. Aspirar e lavar a placa como no passo 4. Adicionar 0,1 ml da Solução Substrato-Cromógeno diluída em todos os poços, inclusive no poço 8 reservado ao Branco de Substrato. 9 Incubar 30 minutos à temperatura ambiente (20-25 ºC) e ao abrigo da luz. Adicionar 0,1 ml da Solução de Parada (n 10 o 11) a todos os poços, respeitando a mesma sequência e os mesmos intervalos de tempo da adição da solução Substrato-Cromógeno. 11 Ajustar o zero da leitora com o poço reservado ao Branco de Substrato em 450 nm e medir a absorbância em cada um dos poços no prazo máximo de 30 minutos. Recomenda-se realizar leitura bicromática utilizando filtro secundário de nm.

18 HBeAg Ref. 416 Sistema para a determinação qualitativa do antígeno e do vírus da hepatite B (HBeAg) em soro ou plasma. ELISA Sanduiche (Ac-Ag-Ac) PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM A Solução de Lavagem Concentrada deve ser diluída 1:25 com água deionizada. Adicionar 40 ml da Solução de Lavagem concentrada (n o 5) a 960 ml de água. Estável 1 semana entre 2 8 C. Para preparar volumes menores seguir a tabela abaixo: Solução Lavagem Concentrada (ml) Água purificada (ml) PREPARO DO CONJUGADO (Preparar no momento do uso) O Conjugado Concentrado (n o 2) deve ser diluído 1:50 com o Diluente do Conjugado (n o 3). Adicionar 0,24 ml de Conjugado Concentrado a 11,76 ml de Diluente de Conjugado e homogeneizar suavemente. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo: Diluente de Conjugado (ml) 0,98 1,96 2,94 3,92 4,90 5,88 6,86 7,84 8,82 9,80 10,78 Conjugado Concentrado (ml) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 VALIDAÇÃO DO ENSAIO As absorbâncias devem ser consideradas após subtração do branco de substrato. O não cumprimento de qualquer destes critérios INVALIDA o ensaio analítico. Branco do Substrato Absorbância 0,150 A absorbância de cada replicata deve ser < 0,120. Se uma replicata se encontrar fora dessa margem, deve-se Caibrador descartá-la e calcular a média com os outros 2 valores. Se 2 replicatas se encontrarem fora dessa margem, o teste deverá ser repetido. Controle Negativo Absorbância < 0,120 Controle Positivo Absorbância entre 0,500 e 2,500 Controle Positivo - Controle Negativo > 0,450 RESULTADOS 1- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador e somar 0,060. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x Calibrador + 0,060 2-Dividir a absorbância de cada amostra pelo Cut-off. 3- Resultados: Amostra Relação Absorbância / Cut-off Reativa ou Positiva 1,10 Não Reativa ou Negativa < 0,90 Inconclusiva 0,90 e < 1,10

19 HBeAg PROCEDIMENTO 1 Deixar um poço vazio para o Branco do Substrato. Transferir 0,05 ml do Tampão de Incubação (n 2 o 4) a todos os poços, exceto ao poço reservado para o Branco de Substrato. Adicionar 0,1 ml do Controle Positivo Alto, Controle Positivo Baixo (1 replicata de cada), Calibrador (3 3 replicatas) e amostras aos poços correspondentes. 4 Cobrir a placa com uma folha adesiva e incubar a 37 C por 120 minutos. Retirar e descartar a folha adesiva. Aspirar o conteúdo dos poços e enchê-los completamente (± 0,350 ml) com a Solução de Lavagem diluída. Repetir o processo de aspiração e lavagem mais 4 vezes, perfazendo um total de 5 ciclos de lavagem. 5 Manter a solução de lavagem nos poços por pelo menos 30 segundos antes de cada ciclo de aspiração. Após a última lavagem, golpear a placa invertida sobre um papel absorvente para eliminar o excesso de líquido Adicionar 0,1 ml do Conjugado diluído em todos os poços, exceto ao poço reservado ao Branco de 6 Substrato. Evitar a formação de bolhas. 7 Cobrir a placa com uma nova folha adesiva e incubar a 37 ºC por 60 minutos. 8 Ao final da incubação retirar a folha adesiva. Aspirar e lavar a placa como no passo 5. 9 Adicionar 0,1 ml da Solução substrato-cromógeno (no 6) em todos os poços, inclusive no poço reservado ao Branco de Substrato. 10 Incubar 30 minutos à temperatura ambiente (20 a 25 C) e ao abrigo da luz. 11 Adicionar 0,1 ml da Solução de Parada (no 10) a todos os poços, respeitando a mesma sequência e intervalos de tempo da adição da solução Substrato-Cromógeno 12 Ajustar o zero da leitora com o poço reservado ao Branco de Substrato em 450 nm e medir a absorbância em cada um dos poços no prazo máximo de 30 minutos. Recomenda-se realizar leitura bicromática utilizando filtro secundário de nm. ORIENTAÇÕES Ler as instruções de uso do produto. Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente (20-25 C) antes de iniciar o ensaio. Os reagentes líquidos devem ser homogeneizados suavemente antes do uso. Realizar as leituras no prazo máximo de 30 minutos após a adição da Solução Substrato-Cromógeno. Caso a leitora não permita o ajuste do zero com o Branco do Substrato, é necessário subtrair seu valor das absorbâncias das amostras e controles.

20 HBsAg Ref. 412 Sistema para a determinação qualitativa do antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg) em soro ou plasma. ELISA Sanduiche (Ac-Ag-Ac) PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM A Solução de Lavagem Concentrada deve ser diluída 1:10 com água deionizada. Adicionar 50 ml da Solução de Lavagem Concentrada (n o 4) a 450 ml de água. Estável 2 semanas entre 2 8 C. Para preparar volumes menores seguir a tabela abaixo: Solução Lavagem Concentrada (ml) Água purificada (ml) PREPARO DO CONJUGADO (preparar no momento do uso) O Conjugado Concentrado (n o 2) deve ser diluído 1:51 com o Diluente do Conjugado (n o 3). Adicionar 0,24 ml de Conjugado Concentrado a 12 ml de Diluente de Conjugado e homogeneizar suavemente. Preparar no momento do uso. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo: Diluente de Conjugado (ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 Conjugado Concentrado (ml) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 PREPARO DA SOLUÇÃO SUBSTRATO-CROMÓGENO (preparar 10 minutos antes do uso) O reagente Cromógeno (n o 6) congela a temperatura 18 C. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 C) para que descongele completamente e homogeneizar bem antes de usar. Preparar 10 minutos antes do uso. Adicionar 0,28 ml do Cromógeno (n o 6) diretamente no frasco de Tampão Substrato (n o 5) que contem 14 ml e homogeneizar bem. A solução para uso é rósea e deve ser mantida em recipiente vedado e ao abrigo da luz. Descartar caso se torne azul. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo: Tampão Substrato (ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 Cromógeno (ml) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 VALIDAÇÃO DO ENSAIO As absorbâncias devem ser consideradas após subtração do branco de substrato. O não cumprimento de qualquer destes critérios INVALIDA o ensaio analítico. Branco do Substrato Absorbância 0,100 A média das absorbâncias deve ser < 0,120 A absorbância de cada replicata deve ser maior do que a média das absorbâncias vezes 0,5. ( x CN x 0,5). Controle Negativo Se uma replicata se encontrar fora dessa margem, deve-se descartá-la e calcular a média com os outros 2 valores. Se duas replicatas se encontrarem fora dessa margem, o teste deverá ser repetido. Controle Positivo Absorbância 0,700 RESULTADOS 1- Calcular a média das absorbâncias do Controle Negativo e somar 0,040. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x Controle negativo + 0,040 2-Dividir a absorbância de cada amostra pelo Cut-off. 3- Resultados: Amostra Relação Absorbância / Cut-off Reativa ou Positiva 1,10 Não Reativa ou Negativa < 0,90 Inconclusiva 0,90 e < 1,10

21 HBsAg PROCEDIMENTO 1 Deixar um poço vazio para o Branco do Substrato. Transferir 0,1 ml do Controle Positivo (1 replicata), Controle Negativo (3 replicatas) e amostras aos poços 2 correspondentes. 3 Cobrir a placa com uma folha adesiva, agitar delicadamente e incubar a 37 C por 60 minutos. Retirar e descartar a folha adesiva. Aspirar o conteúdo dos poços e enchê-los completamente (± 0,350 ml) com a Solução de Lavagem diluída. Repetir o processo de aspiração e lavagem mais 3 vezes, perfazendo um total de 4 ciclos de lavagem. 4 Manter a solução de lavagem nos poços por pelo menos 15 segundos antes de cada ciclo de aspiração. Após a última lavagem, golpear a placa invertida sobre um papel absorvente para eliminar o excesso de líquido Adicionar 0,1 ml do Conjugado diluído em todos os poços, exceto ao poço reservado ao Branco de 5 Substrato. Evitar a formação de bolhas. 6 Cobrir a placa com uma nova folha adesiva e incubar a 37 ºC por 30 minutos. 7 Ao final da incubação retirar a folha adesiva. Aspirar e lavar a placa como no passo 4. 8 Adicionar 0,1 ml da Solução Substrato-Cromógeno diluída em todos os poços, inclusive no poço reservado ao Branco de Substrato. 9 Incubar 30 minutos à temperatura ambiente (20 a 25 C) e ao abrigo da luz. 10 Adicionar 0,1 ml da Solução de Parada (no 9) a todos os poços, respeitando a mesma sequência e intervalos de tempo da adição da solução Substrato-Cromógeno 11 Ajustar o zero da leitora com o poço reservado ao Branco de Substrato em 450 nm e medir a absorbância em cada um dos poços no prazo máximo de 30 minutos. Recomenda-se realizar leitura bicromática utilizando filtro secundário de nm. ORIENTAÇÕES Ler as instruções de uso do produto. Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente (20-25 C) antes de iniciar o ensaio. Os reagentes líquidos devem ser homogeneizados suavemente antes do uso. Realizar as leituras no prazo máximo de 30 minutos após a adição da Solução Substrato-Cromógeno. Caso a leitora não permita o ajuste do zero com o Branco do Substrato, é necessário subtrair seu valor das absorbâncias das amostras e controles.

22 HCV Ref. 418 Sistema para a determinação qualitativa de anticorpos totais específicos contra o vírus da hepatite C (HCV) em soro ou plasma. ELISA Indireto (Ag-Ac-Ac) PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM A Solução de Lavagem Concentrada deve ser diluída 1:10 com água deionizada. Adicionar 50 ml da Solução de Lavagem Concentrada (n o 5) a 450 ml de água. Estável 2 semanas entre 2 8 C. Para preparar volumes menores seguir a tabela abaixo: Solução Lavagem Concentrada (ml) Água purificada (ml) PREPARO DO CONJUGADO (Preparar no momento do uso) O Conjugado Concentrado (n o 2) deve ser diluído 1:51 com o Diluente do Conjugado (n o 3). Adicionar 0,3 ml de Conjugado Concentrado ao frasco que contém 15 ml de Diluente de Conjugado e homogeneizar suavemente. Preparar no momento do uso. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo: Diluente de Conjugado (ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 Conjugado Concentrado (ml) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 PREPARO DA SOLUÇÃO SUBSTRATO-CROMÓGENO (Preparar 10 minutos antes do Uso) O reagente Cromógeno (n o 7) congela a temperatura 18 C. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 C) para que descongele completamente e homogeneizar bem antes de usar. Preparar 10 minutos antes do uso. Adicionar 0,28 ml do Cromógeno (n o 7) diretamente no frasco de Tampão Substrato (n o 4) que contem 14 ml e homogeneizar bem. A solução para uso é incolor e deve ser mantida em recipiente vedado e ao abrigo da luz. Descartar caso se torne azul. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo: Tampão Substrato (ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 Cromógeno (ml) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 VALIDAÇÃO DO ENSAIO (O ensaio será considerado válido apenas se cumprir os critérios abaixo): As absorbâncias devem ser consideradas após subtração do branco de substrato. O não cumprimento de qualquer destes critérios INVALIDA o ensaio analítico. Branco do Substrato Absorbância 0,100 Controle Negativo Absorbância < 0,100 Cada absorbância não deve variar mais do que Controle Positivo Baixo 30% em relação à média das absorbâncias. A média das absorbâncias deve ser 0,200 Controle Positivo Alto Absorbância 0,800 Relação Controle Positivo Alto / Controle Positivo Baixo > 2,5 Relação Controle Negativo / Controle Positivo Baixo < 0,5 RESULTADOS 1- Calcular a média das absorbâncias do Controle Positivo Baixo e multiplicar por 0,9. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x Controle Positivo Baixo x 0,90 2-Dividir a absorbância de cada amostra pelo Cut-off. 3- Resultados: Amostra Relação Absorbância / Cut-off Reativa ou Positiva 1,10 Não Reativa ou Negativa < 0,90 Inconclusiva 0,90 e < 1,10

23 HCV PROCEDIMENTO 1 Deixar um poço vazio para o Branco do Substrato. Transferir 0,2 ml do Controle Positivo Alto, Controle Positivo Baixo e Controle Negativo (2 replicatas de 2 cada) aos poços correspondentes. Não diluir os controles, pois estão prontos para uso. Adicionar 0,2 ml de Diluente de Amostras (n 3 o 4) aos poços correspondentes para as amostras. Adicionar 0,01 ml de amostra em cada poço de amostra. 4 Cobrir a placa com uma folha adesiva e incubar a 37 C por 60 minutos. Retirar e descartar a folha adesiva. Aspirar o conteúdo dos poços e enchê-los completamente (± 0,350 ml) com a Solução de Lavagem diluída. Repetir o processo de aspiração e lavagem mais 5 vezes, perfazendo um total de 6 ciclos de lavagem. 5 Manter a solução de lavagem nos poços por pelo menos 15 segundos antes de cada ciclo de aspiração. Após a última lavagem, golpear a placa invertida sobre um papel absorvente para eliminar o excesso de líquido Adicionar 0,1 ml do Conjugado diluído em todos os poços, exceto ao poço reservado ao Branco de 6 Substrato. Evitar a formação de bolhas. 7 Cobrir a placa com uma nova folha adesiva e incubar a 37 ºC por 30 minutos. 8 Ao final da incubação retirar a folha adesiva. Aspirar e lavar a placa como no passo 5. 9 Adicionar 0,1 ml da Solução substrato-cromógeno diluído em todos os poços, inclusive no poço reservado ao Branco de Substrato. 10 Incubar 30 minutos à temperatura ambiente (20 a 25 C) e ao abrigo da luz. 11 Adicionar 0,1 ml da Solução de Parada (no 11) a todos os poços, respeitando a mesma sequência e intervalos de tempo da adição da solução Substrato-Cromógeno. 12 Ajustar o zero da leitora com o poço reservado ao Branco de Substrato em 450 nm e medir a absorbância em cada um dos poços no prazo máximo de 30 minutos Recomenda-se realizar leitura bicromática utilizando filtro secundário de nm. ORIENTAÇÕES Ler as instruções de uso do produto. Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente (20-25 C) antes de iniciar o ensaio. Os reagentes líquidos devem ser homogeneizados suavemente antes do uso. Realizar as leituras no prazo máximo de 30 minutos após a adição da Solução Substrato-Cromógeno. Caso a leitora não permita o ajuste do zero com o Branco do Substrato, é necessário subtrair seu valor das absorbâncias das amostras e controles.

24 HIV-1+2 Ref. 419 Sistema para a determinação qualitativa de anticorpos contra HIV-1, HIV-2 e subtipo O em soro ou plasma. ELISA Sanduiche (Ag-Ac-Ag) PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM A Solução de Lavagem Concentrada deve ser diluída 1:20 com água deionizada. Adicionar 50 ml da Solução de Lavagem Concentrada (n o 5) a 950 ml de água. Estável 1 semana entre 2 8 C. Para preparar volumes menores seguir a tabela abaixo: Solução Lavagem Concentrada (ml) Água purificada (ml) PREPARO DO CONJUGADO (Preparar no momento do uso) O Conjugado Concentrado (n o 2) deve ser diluído 1:51 com o Diluente do Conjugado (n o 3). Adicionar 0,24 ml de Conjugado Concentrado a 12 ml de Diluente de Conjugado e homogeneizar suavemente. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo: Diluente de Conjugado (ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 Conjugado Concentrado (ml) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 PREPARO DA SOLUÇÃO SUBSTRATO-CROMÓGENO (Preparar 10 minutos antes do uso) O reagente Cromógeno (n o 7) congela a temperatura 18 C. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 C) para que descongele completamente e homogeneizar bem antes de usar. Preparar 10 minutos antes do uso. Adicionar 0,12 ml do Cromógeno (n o 7) a 12 ml de Tampão Substrato (n o 6) e homogeneizar bem. A solução para uso é incolor e deve ser mantida em recipiente vedado e ao abrigo da luz. Descartar caso se torne azul. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume necessário, de acordo com a tabela abaixo: Tampão Substrato (ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 Cromógeno (ml) 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 0,11 VALIDAÇÃO DO ENSAIO As absorbâncias devem ser consideradas após subtração do branco de substrato. O não cumprimento de qualquer destes critérios INVALIDA o ensaio analítico. Branco do Substrato Absorbância 0,100 A média das absorbâncias deve ser < 0,150 A absorbância de cada replicata deve ser maior do que a média das absorbâncias x 0,5 >( x CN x 0,5) e menor ou igual à média das absorbâncias vezes 1,5 ( x CN x 1,5). Controle Negativo Se uma replicata se encontrar fora dessa margem, deve-se descartá-la e calcular a média com os outros 2 valores. Se 2 replicatas se encontrarem fora dessa margem, o teste deverá ser repetido. Absorbância maior ou igual à média do Controle Negativo + 0,700 Controle Positivo HIV-1 ( x CP1 x CN + 0,700) Controle Positivo HIV-2 Absorbância maior que o Cut-off. RESULTADOS 1- Calcular a média das absorbâncias do Controle Negativo e somar 0,250. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x Controle Negativo + 0,250 2-Dividir a absorbância de cada amostra pelo Cut-off. 3- Resultados: Amostra Relação Absorbância / Cut-off Reativa ou Positiva 1,10 Não Reativa ou Negativa < 0,90 Inconclusiva 0,90 e < 1,10

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