Parte IV: Métodos de Diagnóstico de Infecções Virais II MAC VIROLGOIA CLÍNICA QSC_09

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1 Parte IV: Métodos de Diagnóstico de Infecções Virais 1.COLHEITA E TRANSPORTE DAS AMOSTRAS BIOLÓGICAS 2.INOCULAÇÃO DE PRODUTOS BIOLÓGICOS 3.SEPARAÇÃO DE CMSP A PARTIR DE SANGUE TOTAL HUMANO POR GRADIENTE DE FICOLL

2 COLHEITA E TRANSPORTE DAS AMOSTRAS BIOLÓGICAS 1. Obtidas a partir de doentes na fase aguda da doença; 2. Transporte: Em meio tamponado (3-4ml) com 2% de soro bovino fetal, 100 µg/ ml gentamicina e 0,5% de anfotericina B (fungisona) Temperatura: 4ºC por períodos inferiores a 24h; -70ºC por períodos longos. 3. O Sucesso de um isolamento varia inversamente com o tempo decorrido entre a colheita e o início da cultura viral. 4. Ex. de produtos biológicos para Virologia: Zaragatoas (nasais, faríngeas, oculares, rectais, de lesões, etc.) Sangue Fezes Urina LCR Saliva Lágrimas.

3 INOCULAÇÃO DE PRODUTOS BIOLÓGICOS 1. Zaragatoas: introduzir a zaragatoa no meio de transporte, agitar fortemente (vórtex) e espremer. Transferir para novo tubo, centrifugar e inocular. 2. Fezes: fazer uma suspensão a 10% em solução tamponada (BSS). Centrifugar a alta velocidade ( x g durante 60 min.). Ao sobrenadante adicionar gentamicina e incubar min. Inocular em células susceptíveis. 3. Sangue: Colher o sangue em tubo com anticoagulante (heparina/ EDTA-5%PBS). Isolar, por migração diferencial em gradiente de Ficoll-Hipaque (Metrizoato de sódio), o plasma, as células mononucleadas (linfócitos + monócitos) e os polimorfonucleares. Inocular em células susceptíveis. 4. LCR e outros fluidos corporais: inocular directamente.

4 COMO TUDO SE INICIA... ISOLAMENTO DO VÍRUS 1.Separação de sangue total humano por gradiente de Ficoll

5 COMO TUDO SE INICIA... ISOLAMENTO DO VÍRUS II M A C VI RO LG O IA C LÍN IC A Q SC _0 9 1.Separação de sangue total humano por gradiente de Ficoll (contagem das CMSP)

6 CONTAGEM DE CÉLULAS EM HEMATÍMETRO DE NEUBAUER 1mm mm Altura= 0,1 mm Área= 1mm*1mm=1mm 2 Volume= 0,1mm 3 N ( ) 0,1 µl 4 X 1000 µl Diluição com Azul de Tripan 1/10 (90 µl + 10 µl) N/4 * 10 5 células / ml

7 Parte IV cont.: Métodos de Diagnóstico de Infecções Virais 1.MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS: directos e indirectos 2.MÉTODOS DIRECTOS DE DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS a)isolamento viral Detecção da Presença de Vírus em Cultura Identificação de Vírus em Cultura Titulação de Vírus em Cultura b)microscopia Electrónica

8 MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DIRECTO Identificação da presença do vírus ou dos seus componentes na amostra clínica. 1. Demonstração do vírus Microscopia electrónica (ME) Cultura em sistemas celulares Inoculação em ovos embrionados Inoculação em animais 2. Demonstração de componentes do vírus Genoma vírico (PCR, hibridação in situ, Southern ou Northern-blot) Antigénios víricos (IF, IP, ELISA, aglutinação)

9 MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO INDIRECTO Pesquisa de Anticorpos Específicos (IgG, IgM) para um determinado vírus (Serelogia). TÉCNICAS PARA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS: 1. Reacção de Fixação do Complemento (RFC); 2. Reacção de Inibição da Hemaglutinação (IHA); 3. Métodos Imunoenzimáticos (EIA); 4. Métodos ImunoRadioactivos (RIA); 5. Aglutinação; 6. Western Blot (WB).

10 MÉTODOS DIRECTOS DE DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS : 1. Isolamento viral A. Detecção da Presença de Vírus em Cultura Efeito citopático: A presença de alguns vírus pode ser revelada pelas alterações degenerativas que eles induzem nas células infectadas. Estas alterações, que podem ser visualizadas ao microscópio, são denominadas colectivamente como efeito citopático (ECP). Hemadsorção: Alguns vírus alteram a superfície da célula infectada conferindo-lhe afinidade para as hemácias (Vírus Influenza). Interferência viral: Certos vírus que não induzem ECP, são postos em evidência recorrendo à sua capacidade de interferir com a replicação de um segundo vírus (vírus indicador), o qual possui um ECP característico (Vírus da Rubéola + CoxsaKie A9). Hemaglutinação: Alguns vírus produzem proteínas hemaglutinantes que podem ser postas em evidência adicionando suspensão de hemácias de uma espécie adequada (humana, galinha, pinto, etc.) (Virus da Rubéola, Vírus Influenza e Parainfluenza).

11 MÉTODOS DIRECTOS DE DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS : A. Detecção da Presença de Vírus em Cultura: ECP. Enterovirus: Arredondamento das células; Inclusão eosinófila citoplasmática com compressão do núcleo; Nas fases mais avançadas o núcleo deformado aparece mais escuro e a célula diminui de volume. HSV: Arredondamento das células; Nas fases mais avançadas podem aparecer sincícios; Inclusão eosinófila difusa intranuclear. Reovirus: Nas células não coradas o ECP vão é facilmente visualizado; Inclusão eosinófila citoplasmática rodeando o núcleo sem o deformar. Adenovirus: Inclusão intranuclear compartimentada; Nucléolo intacto. HIV, VRS: Formação de sincícios.

12 MÉTODOS DIRECTOS DE DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS : A. Detecção da Presença de Vírus em Cultura. Vírus Exemplos de Células Susceptíveis Herpes Simplex (HSV) Vero, Hep-2 Varicela-Zona (VZV) Células diplóides humanas (HEK, HEL) Citomegalovirus (CMV Fibroblastos humanos (MRC-5 Adenovirus Hep-2, HEK Poliovirus MK, BGM, LLC-MK2, Vero Coxsackie B MK, BGM, LLC-MK2, Vero Echovirus MK, BGM, LLC-MK2 Influenza A e B MK, LLC.MK2, MDCK Parainfluenza MK, LLC-MK2 Papeira MK, LLC-MK2, HEK, Vero Respiratório Sincícial (RSV) Hep-2, Vero Rinovirus HEK, HEL Sarampo MK, HEK Rubéola Vero, RK13

13 MÉTODOS DIRECTOS DE DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS : 1. Isolamento viral A. Detecção da Presença de Vírus em Cultura B. Identificação de Vírus em Cultura Imunofluorescência directa (IFD): usando anticorpos marcados com fluorocromos (FITC). Imunoperoxidase directa: princípio igual ao da IFD; anticorpos marcados com peroxidase. Neutralização: baseia-se na perda de infecciosidade de um vírus devido à interacção com o anticorpo específico.

14 MÉTODOS DIRECTOS DE DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS : 1. Isolamento viral A. Detecção da Presença de Vírus em Cultura B. Identificação de Vírus em Cultura C. Titulação de Vírus em Cultura Método das «placas»: Consiste na quantificação das placas de lise induzidas por uma determinada diluição viral (UFP). Método da diluição limite (end-point dilution): Consiste na inoculação, de diluições crescentes duma suspensão viral, em células susceptíveis. Calcula-se a diluição em que é possível detectar replicação viral em 50% das cultura inoculadas (DI50 ou TCID50). 1 DI50 = 0.7 UFP

15 MÉTODOS DIRECTOS DE DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS : 100uL Método das «placas» UFP/ml 100uL 900uL+100uL 100uL +900uL 100uL +900uL 100uL +900uL 100uL +900uL (Incontáveis) ( P5+P6+P7+P8) ( P5+P6+P7+P8) 1. 1x10 4 células; 2. 3 dias depois, retirar o meio de cultura; 3. Adicionar as diluições dos vírus; 4. 1h depois, adicionar agarose ou sephadex; 5. Cobrir com corante vital Vermelho neutro; 6. Contar as placas de lise. UFP/ ml= X ( P5+P6+P7+P8) 8 1 X V= 0,1mL

16 MÉTODOS DIRECTOS DE DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS : Método da diluição limite (end-point dilution) TCID50%: Ou frascos de cultura com ECP ou infecções Ou frascos de cultura sem ECP, ou não infectados A/(A+B) 10 5,5 Doses Infectantes 50%

17 MÉTODOS DIRECTOS DE DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS : 1. Isolamento viral A. Detecção da Presença de Vírus em Cultura B. Identificação de Vírus em Cultura C. Titulação de Vírus em Cultura 4. Microscopia Electrónica

18 BIBLIOGRAFIA A history of experimental virology / Alfred Grafe ; trad. Elvira Keckendorf. - Berlin : Springer, XI, 343 p. ; 24 cm ISBN , CDU 576.8(091), Cota: 340 B Basic Cell Culture a practical approach, J. M. Davis, May, 2002, ISBN: Virology : laboratory procedure manual / coord. Mayo Foundation. - Rochester : Mayo Foundation, cop IX, 247 p. ; 28 cm. - (Laboratory Procedures in Clinical Microbiology), CDU 576.8, Cota: 340B Clinica Virology Manual, Steven Specter, Richard L. Hodinka, Stephen A. Young; 2000, 3rd Ed Methods and Techniques in Virology, Pierre Payment, Michel Trudel,

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