Imunodiagnóstico. Conceitos. Fatôres que afetam as reações de Ag/Acs. Reatividade Cruzada. Quantificação. da Resposta Imune.

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1 O QU SÃO TSTS SOROLÓGICOS? Imunodiagnóstico Conceitos Prof: Prof: Teresa Teresa Gomes Gomes de de Oliveira Oliveira São técnicas para a detecção e quantificação de antígenos e anticorpos, ou outras substâncias que desempenhem o papel de antígeno no ensaio, tais como drogas, hormônios, ácidos nucléicos, citocinas, receptores de células, etc. Reatividade Cruzada Reações Cruzadas Anti-A Ac Anti-A Ac Anti-A Ac Ag A Ag B pitopo Compartilhado Ag C pitopo similar Quantificação da Resposta Imune Título - Fatôres que afetam as reações de Ag/Acs descreve uma quantidade relativa de ac. dependente do ensaio geralmente expressa como a recíproca da última diluição do soro que forneceu uma reação positiva Não tem unidade

2 Reações de Precipitação Concentração do Antígeno Concentração do Anticorpo Antígeno solúvel Precipitação ocorre na zona de equivalência m tubo são pouco utilizada atualmente (x: PCR - proteína C reativa) Imunodifusão Radial Simples - Mancini Gel contendo Ac anel de precipitação Ag Ag Ag Ag diam. diâmetro desconhecido x x x concentração (mg/dl) Imunodifusão radial simples-teste Quantitativo Dosagem de imuneglobulinas IgM, IgG,IgA AGLUTINAÇÃO Técnica de Mancini

3 Floculação (Aglutinação) de cristais de colesterol VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) cardiolipina de boi é sensibilizada com cristais de colesterol e lecitina pesquisa-se a presença de anticorpos anti-lípidios na sífilis Floculação VDRL cardiolipina de boi Prózona Diluição 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 Reação Observação no microscópio (objetiva 4X e 10X prózona Título =? = 64

4 Fenômeno Prozona Falsos resultados negativos em soros com elevado título de anticorpos aglutinantes Ativa ou direta Aglutinação sse efeito é eliminado empregando-se diluições seriadas do soro + AGLUTINAÇÃO AGLUTINAÇÃO M PLACA GRUMOS Aglut. Positiva Aglut. Negativa SINAL: GRUMOS Aglutinação/Hemaglutinação Passiva ou Indireta Artificialmente adsorve-se se à partículas: antígeno anticorpo anticorpo passiva reversa Prof:Teresa Prof:Teresa Gomes Gomes de de Oliveira Oliveira

5 Aglutinação/Hemaglutinação Passiva ou Indireta + A reação pode ser feita em placas contendo 96 poços Hemaglutinação 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 Hemaglutinação AGLUTINAÇÃO DO LÁTXL Paciente 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Pos. Neg. Título <

6 Inibição da Aglutinação ão/hemaglutinação (teste de Gravidez) Aglutinação/Hemaglutinação Passiva ou Indireta Reversa Teste Negativo Aglutinação + Teste Positivo Sem aglutinação + + Amostra do paciente (HCG) Anticorpos Imunofluorescência Direta Ac marcado com corante fluorescente liga-se ao Ag tecidual Ac marcado com corante fluorescente Ag Tecido Raiva Imunofluorescência Chlamydia trachomatis Indireta Ac liga-se ao Ag tecidual não marcado Anti-Ig marcada com corante fluorescente é usado para detectar a 1 a ligação do anticorpo Qualitativo Semi-Quantitativo Ac não marcado Anti-Ig marcada com Fluorocromo Ag Tecido

7 FAN - células Hep-2 Técnicas Imunoenzimáticas Imunoperoxidase Avrameas e Uriel - Nakame e Pierce (1966) m relação a IF: preparações duradouras não necessita de microscópio de fluorescência Vantagens da peroxidase: baixo peso molecular resultados reprodutíveis fácil visualização da coloração substrato: diaminobenzidina Imunoperoxidase Vírus pstein-barr

8 Técnicas Imunoenzimáticas LISA (enzyme-linked immunosorbent assay) nvgall e Perlmann (1971) nzimas e substratos cromógenos: peroxidase OPD (o-fenilenodiamina) TMB (3,3, 5,5 -tetrametilbenzidina) ABTS (2,2 -diazino do ácido etilbenzotiazolino sulfônico fosfatase alcalina nitrofenilfosfato LISA LISA* tapa 1: Ag (ex. virus) é adicionado ao tubo ou poço tapa 2: Soro do paciente (anticorpos??) é adicionado tapa 3: Ac anti-humano com enzima ligada é adicionado tapa 4: um substrato cromogênico é adicionado tapa 5: Haverá formação de cor, será medida em leitor de LISA *enzyme-linked immunosorbent assay

9 LISA Para a pesquisa de anticorpos Método indireto antígeno anticorpo (amostra) anti-imunoglobulina marcada substrato cromogênico LISA LISA Para a pesquisa de anticorpos Método de captura de IgM Para a pesquisa de antígenos Método de captura anti-igm IgM (amostra) antígeno anti-antígeno marcado Substrato cromogênico anticorpo antígeno (amostra) anti-antígeno marcado substrato cromogênico WSTRN BLOT Western-blotting

10 Western Blot Amostra Positiva Amostra Negativa HIV-1 Western Blot fita1: controle positivo fita 2: controle negativo amostra A: Negativa amostra B: Indeterminada amostra C: Positiva Dot-blotting Testes Rápidos Imunocromatografia

11

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