Métodos sorológicos de Diagnóstico e Pesquisa. Reação Ag-Ac in vitro

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1 Métodos sorológicos de Diagnóstico e Pesquisa Reação Ag-Ac in vitro

2 Testes sorológicos Uso de soro ou outros fluidos biológicos de paciente p/ diagnóstico laboratorial Demonstração de anticorpos específicos = diagnóstico presuntivo (indireto) Demonstração de agente infeccioso ou antígeno do agente = diagnóstico diret

3 Vantagens dos testes sorológicos Rapidez Simplicidade Possibilidade de automação Armazenamento de material biológico Baixo custo operacional Oferta de kits comerciais padronizados

4 Aplicações dos testes sorológicos 1 Diagnóstico presuntivo e diferencial 2 Diferenciação de fases da doença 3 Diagnóstico de alergias 4 Diagnóstico de doenças autoimunes 5 Diagnóstico de imunodeficiências congênitas 6 Seleção de doadores de sangue 7 Seleção de doadores de órgãos para enxertos 8 Dosagens hormonais 9 - Prognóstico da doença 10 Avaliação da eficácia da terapêutica instituída 11 Avaliação da imunidade específica (vacinação) 12 Pesquisa de antígenos em células ou tecidos 13 Pesquisas epidemiológicas 14 - Pesquisa básica e aplicada

5 Áreas de conhecimento que utilizam métodos sorológicos Imunologia Patologia Alergologia Microbiologia (bact., vírus, fungos) Microbiologia (bact., vírus, fungos) Morfologia Hematologia Endocrinologia Oncologia

6 Forças de ligação envolvidas nas reações: Conjunto de reações fracas que estabilizam a ligação entre moléculas de antígenos e de anticorpos: Pontes de hidrogênio Ligações iônicas Forças hidrofóbicas Forças de Van der Waals

7 Fatores que interferem na ligação entre Ag e Ac Especificidade dos anticorpos Afinidade dos Ac Avidez dos Ac Concentração dos Ac e antígenos Classe dos anticorpos envolvidos Pureza dos antígenos utilizados

8 Afinidade x avidez Afinidade: Força de ligação resultante do total de forças não-covalentes entre um único sítio de ligação do Ac e um único epítopo do antígeno. Depende do grau de complementariedade entre as duas moléculas. Ac de baixa afinidade ligam-se de modo Ac de baixa afinidade ligam-se de modo fraco e tendem a se dissociar com facilidade. Ac de alta afinidade estabelecem ligações fortes e mais duradouras.

9 Afinidade x avidez Avidez: Força resultante de interações múltiplas entre uma molécula de anticorpo e os epítopos de um antígeno complexo. Quanto mais sítios de ligação tiver um anticorpo (ex. Fragmento Fab<IgG monomérica<dímero<pentâmero). Em geral quanto maior a avidez, melhor seu efeito biológico final (ex. reconhecimento de antíegos complexos sobre a superfície de patógenos) A baixa afinidade de um Ac pode ser compensada por sua elevada avidez.

10 Fatores que interferem na ligação entre Ag e Ac Concentração dos anticorpos (equilíbrio entre concentração de Ag e Ac) ph do meio de reação Temperatura de reação Tempo de reação

11 Equilíbrio de concentração de Ag e Ac

12 Fatores que interferem na ligação entre Ag e Ac Concentração dos anticorpos (equilíbrio entre concentração de Ag e Ac) ph do meio de reação: ph ácido=desfaz reação Temperatura de reação: em geral o aumento de temperatura torna a reação mais rápida. Cuidado: não deixar denaturar os componentes da reação. Reações com complemento devem ser à baixa temperatura. Tempo de reação: Quanto maior o tempo, mais fortes as ligações Ag-Ac e maior a probabilidade de dar reação positiva. Algumas reações ocorrem em minutos, outros requerem muitas horas. Em geral dependem da quantidade de reagentes usados na reação.

13 Conceitos básicos em sorologia Título Teste de referência Sensibilidade Especificidade Falso-positivo, falso-negativo Reação cruzada Precisão Acurácia ou exatidão Reprodutibilidade Limiar de reatividade (cut off)

14 Título Título de uma soro ou solução de anticorpos (Igs), refere-se à máxima diluição na qual um teste continuando dando reação positiva. Por exemplo, quando dizemos que um soro deu título de 1:5000 para toxoplasmose, significa que mesmo diluindo-se a amostra 5000 vezes, a reação continua positiva. Uma mesma amostra pode ter título de 1:100 em um tipo de teste (por exemplo no teste de precipitação) e título de 1: em outro teste (por exemplo ELISA). Isso dependerá do limiar de detecção de cada ensaio.

15 Teste de referência Teste já conhecido e usado para um determinado propósito, com o qual uma nova metodologia deve ser comparada durante sua padronização. São chamados também de padrão-ouro. Por exemplo, qualquer teste sorológico proposto para o diagnóstico da doença de Chagas, deve ser comparado com o xenodiagnóstico, baseado na demonstração de que o paciente tem o parasita circulante.

16 Sensibilidade de um teste sorológico A sensibilidade de um teste sorológico refere-se à percentagem de resultados positivos na população sabidamente doente, isto é, a proporção de resultados positivos verdadeiros. Resultado falso-positivo = refere-se a reações positivas em indivíduos sabidamente sadios O termo sensibilidade é também usado para definir o limiar de detecção de um método, isto é, a quantidade mínima de Ac detectável.

17 Especificidade de um teste sorológico A especificidade é definida pela percentagem de resultados negativos em pacientes sabidamente sadios, isto é, à proporção de resultados negativos verdadeiros. Em outras palavras, um teste com alta especificidade fornece poucos dados falso-positivos. Resultados falso-negativos: corresponde às reações negativas em pacientes sabidamente doentes.

18 Reação-cruzada Uma reação cruzada é resultado da similaridade tridimensional entre duas moléculas de antígenos diferentes. Assim, um Ac gerado contra uma das moléculas pode reagir com a outra, ainda que sua afinidade seja mais baixa. Um exemplo prático das reações cruzadas é a que se observa entre alguns anticorpos contra leishmania que reagem cruzadamente com antígenos de tripanossomas

19 Precisão Expressa a concordância dos resultados obtidos após várias repetições e traduz a possibilidade de erro acidental do método. Quanto maior a precisão do teste, menor a influência que sofre das condições de execução (temperatura, ph, manuseio, tempo, etc) A B

20 Exatidão ou acurácia Determina a capacidade do teste em fornecer resultados muito próximos ao verdadeiro valor do que está sendo medido. Detecta erro do sistema ou tendência de desvio. A B

21 Reprodutibilidade Refere-se à obtenção de resultados iguais em testes realizados com a mesma amostra, por pessoas diferentes em locais diferentes.

22 Limiar de reatividade ( cut off ) O limiar de reatividade ou cut off de um teste é entendido como o ponto de corte de um teste, isto é, o valor acima do qual se deverá considerar o resultado como positivo. A rigor, não existe um teste sorológico que estabeleça claramente o que é um resultado positivo e um negativo, pois sempre existem amostras cujos resultados ficam em uma zona duvidosa

23 Limiar de reatividade ( cut off ) % a b Títulos A = não doentes; b = doentes

24 Antígenos solúveis e antígenos particulados Reações com antígenos Solúveis: Precipitação em gel Precipitação em meio líquido ELISA Radioimunoensaio Quimioluminscência Western-blot

25 Antígenos solúveis e antígenos particulados Reações com antígenos particulados: Hemaglutinação Aglutinação de látex Imunofluorescência (citometria de fluxo) Imuno-histoquímica

26 Interação Ag Ac Formação de complexos dependente da dose

27 Reação de precipitação em meio líquido

28 Reação de precipitação - OUCHTERLONY

29 Imunodifusão dupla de Ouchterlony

30 Reação de precipitação - MANCINI

31 Imunodifusão radial de Mancini

32 Nefelometria

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34 Reação-cruzada tipagem ABO

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36 Imunofluorescência

37 Imunofluorescência variações do método

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39 Radiação U.V. ou laser photo n

40 Imunofluorescência indireta para Giardia

41 Detecção de autoanticorpos

42 FITC isotiocianato de fluoresceína verde Tex Texas red - vermelha

43 Ensaios Imunoenzimáticos (EIE) UTILIZAM UMA ENZIMA PARA GERAR O SINAL DA REAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

44 ELISA - EnzymeEnzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Método indireto

45 ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Reação indireta

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47 ELISA Método de captura ou sanduíche

48 ELISA Captura para IgM

49 ELISA Competição com anticorpo marcado

50 ELISA Competição com antígeno marcada

51 Western BLOTTING

52 Western BLOTTING

53 Immunoblotting

54 Imuno-histoquímica

55 Radioimunoensaio Antígenos de agentes infecciosos Hormônios medicamentos

56 Radioimunoensaio

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