Conflict of Interest Statement. Fisico. Participou como consultor em projetos voltados a imunoensaios.

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1 Conflict of Interest Statement Fisico. Participou como consultor em projetos voltados a imunoensaios.

2 PRINCIPAIS METODOLOGIAS APLICÁVEIS EM TESTES RÁPIDOS Dr. Stefano Spagna Congresso, Setembro 2007

3 Mercado Global In Vitro Diagnostic (IVD) Imunodiagnóstico in vitro IVD é um mercado já estabelecido e dominado pelo uso de testes imunológicos (imunoensaios). Mais de 20 bilhões de testes são feitos anualmente no mundo. O montante de US$ 25 bilhões é empregado nestes ensaios. 40% EUA 5% América Latina.

4 Testes Rápidos Tabela de desenvolvimento e tecnologia dos imunoensaios no mundo 60 e anteriores Descoberta de vários biomarcadores e testes diagnósticos ligados a doenças e patógenos. Pesquisa de imunoensaios 1980 a Companhias farmacêuticas compram e vendem empresas diagnósticas, consolidando um mercado de gigantes A tecnologia de reação em cadeia da polimerase (PCR) usa ciclos de aquecimento e enzimas específicas para produzir cópias múltiplas de um gen, posicionand-se como ferramente em desenvolvimento de biotecnologia e desenvolvimento de bioprodutos no mudo todo. Tem início a industria do ensaio em microarray O FDA aprova o Analyte Specific Reagents (ASR) para a venda a alguns laboratórios credeciados. O Projeto Genoma Humano é completado. Seqüenciamento em larga escala, automação laboratorial tecnologias de microarray entram em escala comercial Iniciado o projeto de mapeamento de haplótipo (SNPs HAPMAP Project) FDA examina as publicações de triagens clínicas com uso de biomarcadores Testes Laboratoriais Remotos Facilidade de execução Inventados em 1960s Aprimoramentos vão surgindo com o tempo

5 Situação atual dos imunoensaios rápidos Uso fácil. Resultado rápido. Emprega pequeno volume de amostra para o ensaio, p.ex. Saliva, urina ou sangue total. Custo atraente para fabricação e uso dos testes.

6 Testes Rápidos - Metodologias 1 Fundo plástico 2 Membrana 3 Anticorpos 4 Anticorpos 5 Almofada com anticorpos conjugados e marcados com ouro 6-7 Almofadas de amostra/secagem 8 Fita adesiva de cobertura 9 Fita adesiva impressa

7 Desvantagens do método convencional com o uso de ouro coloidal 100 % visualmente negativo 100 % visualmente positivo NEGATIVO POSITIVO Negativo / Positivo dependente do operador Interpretação do resultado pelo técnico. Quantificação difícil Alto coeficiente de variação (CVs).

8 Tecnologia emergente: Partículas magnéticas Substituição direta dos ensaios de coloração, quimioluminescência ou conjugados enzimáticos com partículas coloidais Vantagens imediatas reagentes estáveis sinalestável matrizes biológicas apresentam baixo ruído de fundo magnético barreiras visuais não interferem com campos magnéticos química de conjugados padronizada

9 Ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral Imunoensaio convencional Imunoensaio magnético Anticorpo conjugado Excitação Detecção = Ouro coloidal Enzima Fluoróforos Moléculas luminescentes Substrato enzimático Lus visível ou LASER Visual Absorção Transmissão Reflexão Partículas Superparamagnéticas nm Campo magnético oscilatórios Medidas da magnetização pelas partículas magnéticas

10 Detecção do sinal Testes magnético Teste visual p.ex. Ouro coloidal, partículas coloridas ou fluorescentes, etc. Partículas Super paramagneticas 100 a 300 nm Partículas Coloidais 40 nm

11 Amostra Conjugado Membrana Absorvente

12 Amostra Conjugado Membrana Absorvente Antígenos formando imunocomplexos com conjugados de anticorpos portando partículas superparamagnéticas (SPMP)

13 Almofada de amostra Almofada conjugados Membrana Almofada absorvente Imunocomplexos capturados pelo segundo anticorpo

14 Almofada de amostra Almofada conjugados Membrana Almofada absorvente Medida da magnetização pelas partículas magnéticas em um campo magnético oscilante. Amostra restante absorvida

15 Amostra Conjugados Membrana Absorvente Positivo Negativo

16 Vantagem da detecção Testes qualitativos magnética Identificação do sinal visual é restrito ao topo da membrana exposta Testes qualitativos Métodos magnéticos permitem o uso de todo o volume da membrana

17 Problemas de saude relacionado da contaminacao de comida Intervalo típico de detecção em amostras enriquecidas de carne Instrumento completo, funcionamento total Display colorido Visualização clara dos resultados NEGATIVOS e POSITIVOS Impressão automática dos resultados O código de barras identifica todos os dados do ensaio Mínimo de espaço requerido para operar uso eficiente da bancada Tecnologia de detecção magnética reduzidos intervalos de detecção sem prejuízo na acurácia dos resultados Tempo de leitura de um ensaio é de 30 segundos Envisio PCR Teste de fluxo lateral Intervalo de detecção a concentração do analito depois do enriquecimento necessário para que todos os sistemas indicados pudessem positivar o teste

18 Sistemas de leitura de teste de particulas magnetica

19 Indução Magnética Um magneto, se movendo ao longo de uma bobina induz uma voltagem

20 Projeto de bobinas balanceadas Duas bobinas idênticas, mas com espiras de sentidos opostos, produzem um sinal oscilante sem ruído

21 CONCEITO O campo magnético segue o núcleo de ferrite Fenda de oscilação do campo magnético I = I 0 sin ωt V bobina Quando não há material magnético no local, a medida da voltagem entre as bobinas opostas é ZERO (V + + V - = 0)

22 Desenho do H gap = H 0 sin ωt Sensor V 0 magnético PARTÍCULAS MAGNÉTICAS + Pico do sinal Ruído ÁREA DE CAPTURA MEMBRANA DE FLUXO LATERAL - Pico do sinal A bobina gera uma voltagem mensurável quando apresentado magnetismo pelas partículas magnéticas aprisionadas na zona de captura do ensaio A voltagem gerada pela bobina é diretamente proporcional ao número de partículas magnéticas retidas pela formação de imunocomplexos na área de captura do ensaio

23 United States Naval Medical Research Center: BDRD Biological Defense Research Directorate Dr. Robert Bull Detectadas 10 picogramas/ml Enterotoxina do Stafilococus B. Sinal 28 ensaios contra: Bactérias (esporos e vegetativas), Viral e várias toxinas. Ruído Sistema pode ser 10 a 1000 X mais sensível que os ensaios de fluxo lateral de interpretação visual. US Navy Biological Research Defense Directorate Source:

24 MICT Troponin I Troponina I MAR Teste ct/nl em plasma com heparina MICT ctni test in heparin plasma (0~10 ( 0 10 ng/ml) ng/ml) y = x R 2 = ctni, ng/ml 002O3 Linear (002O3) MAR MICT ctni test in heparin plasma (0~1 ( 0 ng/ml) 1 ng/ml) Teste ct/nl em plasma com heparina y = x R 2 = O3 Linear (002O3) ctni, ng/ml

25 MICT THC Test Teste de THC THC Poly. (THC) 0.25 T/C THC, ng/ml

26 2.500 T/C y = -4E-06x x R 2 = MICT CRP Ensaio CRP Assay de avaliação Dose Response dose-resposta (1~700 ng/ml) (1 a 700 ng/ml) CRP Poly. (CRP) CRP, ng/ml T/C y = x R 2 = MICT CRP Assay Dose Response (1~175 ng/ml) CRP Ensaio de avaliação dose-resposta (1 a 175 ng/ml) CRP Linear (CRP) CRP, ng/ml

27 Tecnologia nova emergente Conclusões Resultados Quantitativos Alta sensibilidade Medições rápidas Tem aplicação em imunoensaios de base sólida ou líquida Custo equiparavel ao convencional Usa formatos e reações químicas já padronizadas

28 Obrigado!