TÉCNICAS DE ESTUDO EM PATOLOGIA

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1 TÉCNICAS DE ESTUDO EM PATOLOGIA Augusto Schneider Carlos Castilho de Barros Faculdade de Nutrição Universidade Federal de Pelotas

2 TÉCNICAS Citologia Histologia Imunohistoquímica Citometria Biologia molecular

3 EXAMES CITOLÓGICOS Analiza células individualizadas/livres Origem: Liquídos orgânicos Urina, liquor, liquido ascítico Punções aspirativas Pulmão, mama, linfonodos, sangue Secreções Escarro, abcessos Lavados cavitários Lavado brônquico Raspados Cervicovaginal

4 EXAMES CITOLÓGICOS Células devem ser fixadas e coradas Fixador mais comum é o álcool 95% Corante hematoxilina eosina Detecção de células neoplásicas, parasitas e bactérias Origem das amostras: Punções aspirativas ou raspados

5 EXAMES CITOLÓGICOS Exemplo: Exame Papanicolau Células do canal endocervical Detecção de cancer do colo do útero Detecta células anormais que podem desenvolver cancer

6 EXAMES CITOLÓGICOS Células normais Alteração = aumento/duplicação do núcleo Pessoa treinada interpretação dos resultados

7 EXAMES CITOLÓGICOS Esfregaço de células sanguíneas Contagem de 200 células e classificação morfológica

8 EXAMES CITOLÓGICOS Anemia

9 BIÓPSIAS Podem ser para diagnóstico ou tratamento - Ablativa ou excicional Remoção de toda a lesão para tratamento - Incisional Retira parte da lesão para diagnóstico Importante: Amostragem deve ser representativa de toda lesão/tecido Não só superficial Pode ser com auxílio de ultrassom para atingir ponto desejado

10 BIÓPSIAS Biópsia em caso de suspeita de câncer pulmonar guiada por tomografia computatorizada

11 BIÓPSIAS Amostras acondicionadas em um fixador Formaldeído a 4% Previne autólise e mantem estrutura celular Volume de 6 a 10 vezes maior que a amostra Amostras devem ser acompanhadas de informações do paciente e de outras observações clínicas Evitar diagnóstico errôneo

12 BIÓPSIAS No laboratório as amostras são parafinizadas, cortadas e amostras significativas do tecido coletado são coradas e analizadas Tecidos corados com corantes simples podem ser analizados em microscópio de luz

13 ANÁLISE HISTOLÓGICA Infiltração de gordura hepática Hematoxilina/eosina

14 ANÁLISE HISTOLÓGICA Mycobacterium tuberculosis Hematoxilina/eosina + Ziehl Neelsen

15 IMUNO-HISTOQUÍMICA Método que associa anticorpos com reagentes específicos para localizar estruturas em células O produto é analizado em microscópio em corte histológico Anticorpos ligados a marcadores fluorescentes Resultado qualitativo Presença/ausência de determinado marcador

16 IMUNO-HISTOQUÍMICA Imunofluorescência direta e indireta Maior especificidade Produzido em coelho Produzido em rato

17 BIÓPSIAS Tecidos corados com anticorpos fluorescentes podem ser analizados em microscópio de fluorescência

18 IMUNO-HISTOQUÍMICA Aplicações Muito importante em certo tipo de neoplasias Classificação precisa depende da identificação de proteínas específicas expressas pelo tipo celular Podem ajudar na identificação da sede primária do tumor Identificação de micrometástases em linfonodos sentinelas

19 IMUNO-HISTOQUÍMICA Aplicações Diagnóstico de neoplasias

20 IMUNO-HISTOQUÍMICA Aplicações Diagnóstico de metástase em linfonodos Anticorpo anticitoqueratina

21 IMUNO-HISTOQUÍMICA Aplicações Diagnóstico de neoplasias Proteína Ki67 comum em neoplasias de mama Muito presente nas células que estão se dividindo < 10% - normal 10 20% - intermediário > 20% - alto

22 IMUNO-HISTOQUÍMICA Neoplasia de mama Proliferação alta Proliferação baixa

23 IMUNO-HISTOQUÍMICA Aplicações Diagnóstico de neoplasias Presença de receptores para Estrogenio e Progesterona Recomendação: Uso de tratamentos que reduzem os níveis hormonais e reduzem taxa de crescimento da neoplasia

24 IMUNO-HISTOQUÍMICA Neoplasia de mama positiva para ER

25 CITOMETRIA Determinação quantitativa de componentes celulares Ligação de substância específica a um componente celular e posterior reconhecimento seletivo Citometria estática (citofotometria) Citometria de fluxo

26 CITOMETRIA Citometria de fluxo Células em suspensão tratadas com um fluorocromo Células passam por um canal e intensidade de cada fluorocromo é mensurada Identificação de constituintes normais: Neutrófilos, macrófagos, etc Identicação de células cancerosas de variados tipos Marcadores na superfície de linfócitos para diagnóstico de leucemia

27 CITOMETRIA Citometria de fluxo HIV Declinio CD4 Princípio da técnica

28 TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR Técnicas de manipulação de DNA e RNA Estão cada vez mais comuns e com menor custo Muitas vezes associadas a diagnósticos mais precisos e precoces

29 TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR Hibridação molecular Característica da estrutura do DNA bases são complementares

30 TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR Hibridação molecular Sondas de DNA São como os anticorpos porém para sequências específicas de DNA Sondas são acopladas a compostos fluorescentes ou radioativos Qualquer tipo de amostra pode ser submetido a esta técnica

31 TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR Alterações cromossômicas são comuns em diversas neoplasias Translocações Genes mudam de posição ou de cromossomo Amplificações Genes ou regiões gênicas são duplicadas Deleções Genes são deletados e não são mais detectados

32 ALTERAÇÕES NÍVEL CROMOSSÔMICO Deleção Inversão Duplicação

33 ALTERAÇÕES NÍVEL CROMOSSÔMICO Translocação

34 TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR FISH hibridização fluorescente in situ Coloração de cromossomos

35 TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR Sonda para sequência do cromossomo 3 - Leucemia

36 TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR Deleção do gene PTEN em cancer de prostata

37

38 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE Reação em cadeia da polimerase: Funciona como uma replicação in vitro São adicionados todos os ingredientes para o funcionamento da DNA polimerase 1.Água 2.MgCl 2 3.Tampão 4.dNTPs (A, T, C, G) 5.Taq DNA Polimerase 6.Primers 7.DNA Termociclador: controle da temperatura

39 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

40 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

41 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

42 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE Presença de DNA de vírus, bactéria Diagnóstico HIV sensibilidade e especificidade > 99% Genotipagem para mutação no p53:

43 AUTOPSIA OU NECROPSIA Exame post-mortem de órgãos para se determinar a causa da morte e conhecer as lesões existentes De interesse cientifico para correlacionar a causa da morte com achados clínicos e melhorar o diagnóstico em vida Ainda há uma discordância entre os diagnósticos clínicos e de autópsia

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