BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA. Aplicação no Laboratório Clínico - PCR APLICAÇÃO DA BIOTECNOLOGIA NO LABORATÓRIO CLÍNICO

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1 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA APLICAÇÃO DA BIOTECNOLOGIA NO LABORATÓRIO CLÍNICO Conteúdos abordados -Relembrar alguns conceitos da Replicação do DNA in vivo Aplicação no Laboratório Clínico - PCR -Algumas técnicas para detecção e quantificação de ácidos nucléicos em amostras clínicas síntese de DNA in vitro Prof. Juliana Schmidt Curso Farmácia 2012 APLICAÇÃO NO LABORATÓRIO CLÍNICO- Bibliografia BIOTECNOLOGIA NO LABORATÓRIO ALBERTS, B.; BRAY, D.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WATSON, J.D. Biologia molecular da célula. 3.ed. Artes Médicas Sul Ltda.: Porto Alegre CIRIADES, Pierre G. J. (Ed.). Manual de patologia clínica: análises clínicas, toxicologia, biologia molecular, citologia e anatomia patológica. São Paulo: Atheneu, p. : ISBN (enc.) FARAH, Solange Bento. DNA: segredos & mistérios. São Paulo: Sarvier, 2007 LODISH, Harvey (Et al.) Biologia celular e molecular. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, KREUZER, Helen; MASSEY, Adrianne. Engenharia genética e biotecnologia. 2. ed. Porto Alegre:Artmed, MALACINSKI, George M.. Fundamentos de biologia molecular. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, WATSON, J. et.al. Biologia molecular do gene. 5. ed. Porto Alegre: Artmed Insumos Técnicas APLICAÇÃO NO LABORATÓRIO CLÍNICO ANÁLISES BIOQUÍMICAS MICROBIOLÓGICAS IMUNOLÓGICAS MORFOLÓGICAS Análise do gene e não de seu produto Não depende da expressão do gene (proteínas ou enzimas) expressão variável expressão tardia DIAGNÓSTICO MOLECULAR INVESTIGAÇÕES FORENSES doenças genéticas doenças infecciosas (HIV, Clamídia,...) Detecção de alteração genética Deleção Inserção Rearranjo Mutação 1

2 Aconselhamento genético Risco de recorrência Prognóstico Possíveis tratamentos Diagnóstico pré-natal Início do tratamento durante a gestação ou logo após o nascimento Coleta de amostras de tecido fetal Amniocentese (16ª) Diagnóstico correto da doença Estabelecer padrão de herança Probabilidade de gerar outro filho afetado Coleta de vilosidades coriônicas (8-12ª) Diagnóstico pré-natal Análise dos cromossomos ao microscópio Extração do DNA e análise direta de um gene Algumas Doenças Genéticas Fibrose cística (CFTR) Doença de Gaucher Doença de Huntington Câncer de mama/ovário (BRCA1 e BRCA2)... Lise celular Extração de RNA e proteínas Precipitação do DNA Quantificação do DNA Tratamento com enzimas de restrição INVESTIGAÇÕES FORENSES Identificação de pessoas (suspeitos de crimes, cadáveres,...) Investigação de paternidade e maternidade (trocas de bebês, alteração do pai no registro civil,...) Uso de qualquer fonte de material genético (pelos, saliva, esperma, tecidos) Alto poder discriminatório (1/1 bilhão) Sensibilidade Sistema ABO e Rh Sistema HLA Tipagem molecular de DNA Maior estabilidade relativa do DNA DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS INFECCIOSAS Detecção e/ou quantificação do DNA ou RNA do agente etiológico Microrganismos cultivos demorados (M. tuberculosis 6semanas 4h) não existe paciente já toma antibióticos método ACELERA de cultivo DIAGNÓSTICO cultivos difíceis E O (Clamídia, TRATAMENTO Micoplasma) DO PACIENTE vírus auxilia no diagnóstico qdo sorologia complicada (reações cruzadas, diferenciar infecção antiga de ativa) detecta pequenas qtdes do patógeno (antes da infecção ativa, janela imunológica) 2

3 PREPARO DAS AMOSTRAS PCR Reação em Cadeia da Polimerase Sangue, Tecidos, Urina,... Coleta material estéril Cuidados para evitar contaminação do operador, do ambiente e da amostra -Formação de aerossóis (pipetagem, centrifugação) -Degradação por Dnases e RNases LISE EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS PRECIPITAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS CONSERVAÇÃO Kary Mullis Amplificação de um segmento de DNA (segue as regras básicas da replicação) Desnaturação da dupla fita de DNA Anelamento de oligonucleotídeos Síntese da nova cadeia pela DNA polimerase ETAPAS DA PCR DESNATURAÇÃO Abertura da dupla fita de DNA ETAPAS DA PCR ANELAMENTO Hibridização dos oligonucleotídeos (iniciadores ou primers) com DNA alvo REPLICAÇÃO Helicases PCR Temperatura (93-95 C) REPLICAÇÃO RNA Primase PCR DNA In vitro (55-65 C) ETAPAS DA PCR EXTENSÃO PCR Reação em Cadeia da Polimerase Síntese da nova cadeia no sentido 5 3 pela DNA polimerase 3

4 COMPONENTES DA PCR Amplificação exponencial - Polimerase termoestável: Taq DNA polimerase (Thermus aquaticus) - Molde (pareamento de bases que direciona a cópia da cadeia) - Primers (oligonucleotídeos com sequência complementar se anelam para fornecer ponta 3 -OH livre para polimerase atuar) - dntps(a,t,c,g) - Tampão com Mg - Termociclador Síntese de DNA em larga escala repetição do ciclo 30 a 35 vezes Amplificação exponencial Amplificação exponencial Fase inicial Fase exponencial Platô N = N o 2 n 2 35 = 34 bilhões de cópias N = número de moléculas amplificadas N o = número inicial de moléculas n = número de ciclos de amplificação Especificidade Amplifica segmentos de DNA-alvo mesmo na presença de DNA de diversas origens VISUALIZAÇÃO DO RESULTADO DA PCR Há produto formado? O produto é do tamanho esperado? Outros produtos não esperados foram formados? Sensibilidade Amplificação de até uma única molécula de DNA-alvo 4

5 VISUALIZAÇÃO DO RESULTADO DA PCR PCR Reação em Cadeia da Polimerase - Quantidade insuficiente de DNA deixou de ser limitação no diagnóstico - Permite detecção de quantidades mínimas de DNA alvo em amostras clínicas (mesmo com grande qtde de DNA do hospedeiro ou de outro patógeno) -Necessidade de materiais e espaço reservado para evitar contaminações cruzadas -Necessidade de Termociclador Poço com estreptavidina + sonda-biotina + Amplificado-digoxigenina Ac anti digoxigenina-fosfatase alcalina + substrato = COR PCR automatizada VARIAÇÕES DA PCR Amplificação do ácido nucléico alvo Hibridização do produto amplificado com um oligonucleotídeo específico (sonda) Detecção do produto amplificado, ligado a sonda, pela formação de cor. (Cobas Amplicor Roche) PCR MULTIPLEX PCR ANINHADA (NESTED) RT-PCR PCR EM TEMPO REAL Combina cinco instrumentos em um só sistema: Termociclador Incubadora Lavadora Pipetador Fotômetro ANEMIA FALCIFORME - Identificação direta da mutação DETECÇÃO / QUANTIFICAÇÃO DE PATÓGENOS Clamídias HIV HPV HBV HCV Limites de detecção Qualitativos ~50-200U/mL Quantitativos ~ U/mL M. tuberculosis Micoplasmas,... Amplificação específica da região do gene que apresenta a mutação 5

6 Investigações Forenses 6

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