VI Congresso Brasileiro de Biossegurança Simpósio Latino-Americano de Produtos Biotecnológicos

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1 VI Congresso Brasileiro de Biossegurança Simpósio Latino-Americano de Produtos Biotecnológicos Rio de Janeiro, setembro de 2009 Universidade do Estado do Rio de Janeiro - UERJ Construções Mais Comuns de OGMs - Aspectos de Biossegurança More common GMOs constructions - Biosafety aspects Adriana Sotero Martins Fundação Oswaldo Cruz Escola Nacional de Saúde Pública

2 O que é a clonagem molecular (definição) Quais os objetivos da Clonagem Molecular

3 Expressões utilizadas com o mesmo significado Clonagem molecular Engenharia genética Manipulação gênica Clonagem Gênica Tecnologia do DNA recombinante Modificação Genética Nova Genética A clonagem molecular é o processo de construção de moléculas de DNA recombinante e da sua propagação em hospedeiros apropriados que possibilitam a seleção do DNA recombinante. Esta tecnologia permite estudar os genes e os seus produtos, obter organismos transgênicos e realizar a terapia gênica.

4 Fenômeno Comum na Natureza Recombinação entre moléculas de DNA de diferentes origens "Conversão Lisogênica" Ex. de engenharia genética na natureza Fago λ inserie o seu genoma no cromossoma de Escherichia coli MUDANDO O SEU CONTEÚDO GENÉTICO E TORNANDO-SE PATOGÊNICA. Bactéria Corynebacterium diphtheriae infectada pelo vírus β, produz a toxina, após insersão do genoma viral no cromossoma bacteriano, responsável pelos sinais e sintomas da difteria.

5 Fenômeno Comum na Natureza Recombinação entre moléculas de DNA de diferentes origens Ex.Bactéria Agrobacterium tumefaciens, parasita de plantas, a inserção do DNA exógeno provoca a formação do tumor COROA DE GALHA (a) Plasmídio Ti (indutor de tumor) 200 kb (b) Células lesadas da planta produzem composto fenólico, que induzem os genes de virulencia (vir), estes codificam enzimas necessárias para introdução do segmento de DNA T (23 kb) nas células da planta. O gene T codifica hormônio de crescimento e opinas que é usada como fonte de nutriente pela bactéria parasita.

6 Desenvolvimento da Clonagem Molecular

7 Objetivos Gerais da Clonagem Molecular (1)

8 Objetivos Gerais da Clonagem Molecular (2) A clonagem molecular permite isolar e amplificar uma seqüência particular de DNA a partir de uma mistura complexa de fragmentos, porque se formam moléculas de DNA recombinante independentes do genoma do hospedeiro, que replicam numerosas vezes no hospedeiro.

9 Moléculas Centrais da Clonagem Molecular Os ácidos nucléicos são as moléculas centrais da clonagem molecular O DNA é utilizado como vetor de clonagem ou como inserto O cdna, obtido a partir do mrna, é utilizado como inserto DNA e RNA obtidos por clonagem molecular são utilizados como sondas de hibridização na identificação, quantificação e caracterização de outros ácidos nucléicos

10 Etapas da Clonagem Molecular

11 Especificação das Etapas de Clonagem Molecular (A) Construção do DNA recombinante - Preparação do DNA vetor de clonagem - Preparação do DNA inserto (Diferentes Métodos de Produção) - Ligação do DNA vetor e inserto (B)Transformação -Seleção do melhor sistema vetor/hospedeiro - Introdução do DNA recombinante no hospedeiro (C) Amplificação - Seleção de clones recombinantes (transformados) - Identificação dos clones recombinantes - Manutenção em coleção (D) Isolamento do DNA recombinante - Purificação do DNA recombinante

12 A- Construção do DNA recombinante 1- Preparação do Vetor de Clonagem (Escolha do Mais Apropriado *) Digestão com enzima(s) de restrição Modificações das extremidades do DNA (preenchimento e remoção de extremidades; adição de ligadores ou de adaptadores; adição de caudas de homopolímeros, etc) 2- Produção dos Fragmentos de DNA inserto Digestão com enzimas de restrição Digestão parcial com DNase I Quebra mecânica controlada Síntese enzimática (cdna, PCR) Síntese química de oligodesoxirribonucleótidos 3- Ligação do DNA vetor e inserto DNA ligase

13 Vetor são veículos utilizados para introdução e manutenção de um DNA exógeno em um hospedeiro. Condições de um bom vetor: Ter propriedades que facilite a sua ligação ao DNA clonado ex. sítios de multipla clonagem Ter propriedades para seleção de hospedeiros que contenham o DNA recombinante Possibilitar a expressão da mensagem exógena inserida no hospedeiro (se for o caso também será vetor de expressão. Propriedades que colaborem para não proliferação ambiental do DNA clonado. Vetores de Clonagem (Escolha do Mais Apropriado *)

14 Vetores especializados em diversas funções 1)Vetores de expressão Ori Marcador de seleção Promotor Rib Codon de iniciação da tradução Pelo menos 1 sítio de restrição 2) Vetores de expressão-secreção Antes do sítio de clonagem tem a sequencia do peptídio sinal 3) Vetores especialistas em clonagem de promotores Contem um gene reporter sem promotor e na frente o sítio de clonagem 4) Vetores integrativos Vetores bifuncionais Com marcador genético para dois hospedeiros Ori para apenas um hospedeiro, usados em S. cerevisiae para disrupção gênicia

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17 Fago λ

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19 Conjuga a eficiência da infecção do fago com a vantagem do DNA replicado como um plasmídeo e possuem marcador de resistência a antibióticos. sítios cos promovem a embalagem do fago

20 YACs: (Yeast Artificial Chromosome) cromossomo artificial de levedura Variação de um vetor de cópia única, que contêm: - sequências centroméricas (CEN) - sequências teloméricas São replicados como moléculas lineares de DNA cromossomal. - Usado na caracterização de grandes segmentos genômicos - fragmentos de 100 a 2000 kb

21 Métodos de Introdução de DNA no Hospedeiro

22 Construções de Bibliotecas de DNA recombinante

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25 Métodos de seleção de clones recombinantes Seleção Indireta Seleção Direta

26 Métodos de identificação de clones recombinantes Análise de Padrão de Restrição Por Sequenciamento Por Hibridização de colônias Por Southern PCR Análise de Produtos Gênicos Por reconhecimento imunológico

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31 Exemplo de Estratégia de Utilização Uso de 2 plasmídeos para criar planta recombinante (a)plamídeo 1 sem o gene DNA T, mas com o gene vir, que controla a transferência para o genoma da planta do segmento contendo o gene desejável presente no 2º. plasmídeo (b)plamídeo 2 com o gene de interesse flanqueado por 25 pares de bases de repetição do DNA T

32 Planta de tabaco tendo como inserto o gene da luciferase do vaga-lume expresso Planta foi aguada com solução de luciferina, substrato para a enzima produtora de luz

33 Exemplo de DNA recombinante inserido no Genoma Estudo de Via de Endereçamento Construção e expressão do gene quimérico ASP3-GFP. (1)etapa de produção do cassete de fusão por PCR, in vitro. (2)transformação com o cassete de fusão e recombinação homóloga, in vivo. (3)seleção da construção desejada. (4)produto do gene quimérico, após transcrição e tradução.

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36 Tese de Dissertação de Mestrado da aluna Meryellen Iannuzzi, 2005 Programa Multiinstitucional de Pós-graduação em Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas

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