ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE

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1 ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE

2 ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE Importância da Engenharia Genética Diversidade biológica X Diversidade gênica Etapas básicas da Clonagem Escolha e amplificação do gene Digestão do DNA com Enzimas de Restrição Escolha e Estrutura dos plasmídeos Ligação dos Insertos Transformação de um organismo Selecionar os organismos modificados

3 Importância da Engenharia Genética Análises de DNA (paternidade, forense, predisposição a doenças). Melhoramento de culturas e maior produtividade de alimentos (transgênicos). Produção de Vacinas e Medicamentos Imuno-Biológicos. Melhoramento de Processos Industriais (áreas de energia, meio ambiente etc) Volume 409 Number 6822 Pages February 2001 Vol 291, Issue 5507, Pages February 2001 Quebra-cabeças de bilhões de peças que montam uma peça.

4 Diversidade Biológica Homo sapiens Arabidopsis thaliana Mus musculus Caenorhabitis elegans Drosophila melanogaster Mycobacterium leprae Vibrio cholerae Plasmodium falciparum Mycobacterium tuberculosis Neisseria meningitidis Helicobacter pyroli Xylella fastidiosa Bacillus subtilis Chlamydia pneumoniae Pseudomonas aeruginosa E. coli Saccharomyces cerevisiae Yersinia pestis Salmonella enterica Schizosaccaromyces pombe

5 Diversidade Biológica X Diversidade gênica

6 (HAR1) Human Accelerated Region 1 A região HAR1, assim como 98,5% do nosso genoma, não codifica nenhuma proteína Em 6 milhões de anos a evolução mudou 1% do genoma

7 Etapas básicas da Clonagem Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão). Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA capaz de auto replicar-se). Essas moléculas geralmente são plasmídios ou DNA viral. Ligar, covalentemente, estes 2 fragmentos de DNA. A enzima que faz esta ligação entre o vetor de clonagem e o DNA a ser clonado é a DNA ligase. Esse DNA composto de moléculas de origem diferente é chamado de DNA recombinante ou DNA quimérico. Transferir o DNA recombinante do tubo de ensaio para uma célula hospedeira que emprestará sua maquinaria enzimática para a replicação deste DNA. Selecionar ou identificar as células hospedeiras que contém o DNA recombinante.

8 Etapas básicas da Clonagem

9 Escolhas Iniciais e Preparação Clonagem de genes ou trechos de DNA Clonagem de todo o DNA mrna Purificar o mrna DNA Purificar o DNA DNA Purificar o DNA Transcrição reversa (mrna cdna) Amplificação da região ou gene de interesse Digestão do DNA

10 Transcrição Reversa Molde a ser transcrito reversamente (mrna) Transcriptase reversa Primer (oligonucleotideo dt = TTTTTTTTTTTT) dntps (ATP, CTP, TTP, GTP) Tampão adequado

11 Amplificação de DNA (PCR Reação em cadeia da polimerase) Molde de DNA a ser copiado DNA polimerase Primers (senso e anti-senso) dntps (ATP, CTP, TTP, GTP) Tampão adequado

12 Digestão de DNA (Endonucleases) DNA a ser digerido Endonuclease Tampão adequado

13 Análise de fragmentos de DNA (eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida) DNA já digerido ou produto de amplificação Tampão adequado Aplicação no gel e início da corrida (corrente elétrica) Visualização usando molécula fluorescente à luz UV que liga no DNA (brometo de etídeo)

14 Análise de fragmentos de DNA (eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida)

15 Southern e Northern Blot (Identificação de DNA e mrna em membranas de nylon) Fragmentos de DNA (ou RNA) separados por peso molecular usando-se eletroforese em gel são transferidos para membranas. A técnica, quando usada para DNA, é chamada de Southern Blot A técnica, quando usada para RNA, é chamada de Northern Blot

16 Southern e Northern Blot

17 Fingerprint de DNA

18 Relembrando as etapas iniciais da clonagem Clonagem de genes ou trechos de DNA Clonagem de todo o DNA mrna DNA DNA Purificar o mrna Purificar o DNA Purificar o DNA Transcrição reversa (mrna cdna) Amplificação da região ou gene de interesse (PCR) Conferência usando eletroforese Digestão do DNA Conferência usando eletroforese (só se oriundo de 3)

19 Etapas seguintes da clonagem Digestão do DNA Digestão do plasmidio Ligação Transformação Seleção

20 Ligação (escolha do vetor - plasmídeo)

21 Ligação (pontas coesivas e não coesivas)

22 Transformação e Seleção (inserção dos vetores em outros organismos) As bactérias ainda são os organismos mais usados para clonar DNA heterólogo A seleção pode ser feita pela habilidade de sobreviver a antibióticos ou crescer em meios de cultura pobres em algum aminoácido ou nutriente

23 Uso de bacteriófagos como vetores: o fago λ tem DNA de dupla fita Outras Técnicas: Biblioteca genômica

24 Outras Técnicas: Microarrajo de DNA

25 Outras Técnicas: Microarrajo de DNA Array de 1046 cdnas testado com cdna marcado de feito de mrna de medula óssea. O nível de hibridização segue as cores do espectro, com vermelho sendo a maior expressão e azul a menor

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