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1 PCR Real-time thermal cycler Standard thermal cycler

2 Tópicos (1) Estratégias gerais de estudo de sequências de DNA específicas em populações de DNA complexas Requisitos da reacção de polimerização em cadeia (PCR) Construção de primers Descrição da técnica de PCR Análise dos produtos de PCR Características das polimerases de DNA utilizadas em PCR Clonagem de produtos de PCR Estratégias de clonagem de produtos de PCR

3 Variantes da técnica de PCR RT-PCR RT-PCR modificado RACE-PCR Nested PCR PCR alelo-específico Linker-primed PCR PCR inverso Meta-PCR PCR mutagénico PCR multiplex PCR e RT-PCR em tempo real Aplicações da técnica de PCR Tópicos (2) Triagem de bibliotecas aleatórias (shotgun) Diagnóstico clínico (detecção de mutações RFLPs, deleções) Diagnóstico forense (amplificação de diferentes regiões polimórficas) Detecção de vírus e organismos patogénicos (primers específicos) Clonagem de genes por PCR com primers degenerados Determinação do sexo de fetos em risco de adquirir uma doença ligada ao cromossoma X

4 Estratégias gerais de estudo de sequências de DNA específicas em populações de DNA complexas

5 Descrição da técnica de PCR (1) N Novas cadeias de DNA

6 Descrição da técnica de PCR (2)

7 Descrição da técnica de PCR (3)

8 Análise dos produtos de PCR

9 Características das polimerases de DNA utilizadas em PCR

10 Clonagem de produtos de PCR

11 Estratégias de clonagem de produtos de PCR

12 Adição de locais de restrição aos produtos de PCR

13 Sistema de clonagem T-A Os produtos de PCR frequentemente têm uma adenosina projectada nas extremidades 3. O sistema de clonagem T-A envolve um polylinker com timinas complementares projectadas para facilitar a clonagem.

14 Vector pt-adv

15 Sistema de clonagem TOPO-TA

16 Vector pcr4-topo

17 Vector pcr4blunt-topo

18 RT-PCR Permite detectar baixos níveis de expressão génica. Facilita a construção de bibliotecas de cdna ou a clonagem de cdnas específicos.

19 Triagem multiplex da expressão génica pelo método do mrna differential display RT-PCR modificado (primer oligo dt modificado) Células em estádios fisiológicos ou de desenvolvimento diferentes Dias As diferenças nas bandas entre as fontes de RNA (A e B) comparadas indicam expressão diferencial. Identificação de genes diferencialmente expressos em diferentes estádios de desenvolvimento do coração de ratinho.

20 3 RACE-PCR (1) A técnica de RACE (amplificação rápida das extremidades do cdna) facilita o isolamento de sequências das extremidades 5 e 3 dos cdnas, permitindo obter cdnas completos. É uma variante da técnica de RT-PCR em que um dos primers tem uma sequência âncora adequada (muitas vezes >15 nts.) na extremidade 5. A sequência extra 5 pode ser: um local de restrição adequado para a clonagem do cdna uma componente funcional, por exemplo um promotor para a regulação da expressão um nucleótido modificado contendo um grupo repórter (nucleótido biotinilado) ou um grupo marcado (fluoróforo).

21 5 RACE-PCR (2) Quando não se conhece parte da sequência do gene são utilizados primers aleatórios.

22 Nested PCR Este tipo de PCR aumenta a especificidade da amplificação.

23 PCR alelo-específico (1) A PCR alelo-específico ou PCR baseada no sistema ARMS (sistema de mutação refractário à amplificação) depende do emparelhamento perfeito das bases dos nucleótidos da extremidade 3 dos primers, permitindo a distinção entre alelos que diferem num único nucleótido, isto é, a detecção de mutações pontuais específicas associadas a doenças.

24 PCR alelo-específico (2) São também adicionados primers de controlo que amplificam sequências não relacionadas para testar a reacção de amplificação. CON Primer conservado

25 Esta técnica permite a amplificação indiscriminada de sequências de DNA. Linker-primed PCR

26 PCR inverso As extremidades 3 dos primers têm direcções opostas. Ligase de DNA Baixas concentrações de DNA favorecem a formação de moléculas de DNA circular por ligação intramolecular. Esta técnica permite a clonagem de sequências de DNA adjacentes a uma sequência conhecida a partir de um molde circularizado.

27 Meta-PCR (PCR de ligação de DNAs) Primers com linkers que emparelham nas extremidades exões com cerca de 20 pb de intrão flanqueante Os linkers permitem a formação de concâtemeros quando os primers se esgotam. A técnica de meta-pcr permite ultrapassar a disparidade entre a dimensão média dos exões humanos (145 pb) e a dimensão óptima do produto de sequenciação ( pb) no estudo do DNA genómico.

28 PCR mutagénico A introdução de um local de restrição artificial de diagnóstico permite detectar mutações pontuais associadas a doenças. N - Homozigótico normal H - Heterozigótico M - Homozigótico mutante

29 (A) PCR multiplex (1) Produtos de PCR multiplex de nove exões do gene da distrofina Os primers foram seleccionados de modo a que os exões com as sequências intrónicas flanqueantes origininassem produtos de PCR com dimensões diferentes. Indivíduos do sexo masculino Técnica que envolve amplificações simultâneas na mesma reacção para detectar deleções homozigóticas ou hemizigóticas porque a sequência deletada não amplifica por PCR.

30 PCR multiplex (2) Mutações no gene da distrofina em indivíduos do sexo masculino Interpretação dos resultados obtidos em 1: as linhas sólidas representam exões deletados, as linhas a tracejado representam possíveis extensões das deleções nos exões não testados.

31 PCR em tempo real (1)

32 PCR em tempo real (2)

33 Clonagem de genes por PCR com primers degenerados A partir da sequência de 32 aminoácidos da oxidase de urato foram construídos primers degenerados, utilizados em RT-PCR de mrnas extraídos de fígado de porco.

34 Determinação do sexo de fetos em risco de adquirir uma doença ligada ao cromossoma X

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