PROSPECÇÃO DE GENES REGULATÓRIOS E ESTRUTURAIS DE BOTÃO FLORAL DE ALGODOEIRO MORGANNA POLLYNNE N. PINHEIRO

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1 UFRPE - Universidade Federal Rural de Pernambuco Programa de Pós Graduação em Melhoramento Genético de Plantas PROSPECÇÃO DE GENES REGULATÓRIOS E ESTRUTURAIS DE BOTÃO FLORAL DE ALGODOEIRO MORGANNA POLLYNNE N. PINHEIRO Orientador: Prof. Dr. Péricles de Albuquerque Co-Orientador (a): Drª. Liziane Maria de Lima Recife PE Outubro/2009

2 ROTEIRO 1. INTRODUÇÃO 2. JUSTIFICATIVA 3. OBJETIVOS 4. MATERIAL E MÉTODOS 5. RESULTADOS ESPERADOS 6. CRONOGRAMA 7. ORÇAMENTO

3 INTRODUÇÃO Classificação Taxonômica G. hirsutum Classe: Dicotiledoneae Ordem: Malvales Família: Malvaceae Gênero: Gossypium Espécie: G. hirsutum Raça: G. hirsutum latifolium

4 INTRODUÇÃO Cultura do algodão Gossypium hirsutum Importância econômica Algodão x Biotecnologia Cultivares precoces e de ciclo determinado Produtividade Qualidade da fibra Plantas geneticamente modificadas - ataque de insetos

5 JUSTIFICATIVA Pragas do algodoeiro Ordens Coleoptera e Lepidoptera Hábito endofítico Período mais crítico: 60 e 110 dias Controle: agro-químicos sintéticos Anthonomus grandis Heliothis virescens Pectinophora gossypiella Spodoptera frugiperda

6 JUSTIFICATIVA Plantas GM Liberar proteínas com atividade inseticida apenas para o inseto-alvo; Expressar somente no tecido específico Botão floral: vários genes promissores que são dirigidos por sequências regulatórias tecido -específico Botão floral do algodoeiro (G. hirsutum)

7 OBJETIVOS Objetivo Geral: Prospectar genes tecido - específico e contribuir para a estudos de promotores que poderão ser utilizados nos projetos de transformação genética de plantas Objetivos Específicos: 1. Construir uma biblioteca subtrativa de cdna a partir de RNA total extraído de tecidos de planta de algodão (botão floral versus demais tecidos vegetais); 2. Sequenciar os clones gerados; 3. Realizar análise in silico para identificar os cdnas obtidos e selecionar genes diferenciais; 4. Analisar a expressão dos genes selecionados via RT-PCR e Northern blot

8 METODOLOGIA 1. Material Vegetal Plantas de algodão (G. hirsutum) BRS 8H Tecidos vegetais (botão, folha, raíz, caule) 2. Extração de RNA Concert RNA extraction kit (QIAGEN) Invisorb Kit (Invitec) Analisados em gel de agarose a 1% e quantificados no espectrofotômetro

9 METODOLOGIA 3. Construção da biblioteca subtrativa de cdna Botões florais versus raiz, caule e folha RNAs poli-a+ Super SMART PCR cdna Synthesis Kit (Clontech) Biblioteca PCR-Select cdna Subtraction Kit (Clontech)

10 BIBLIOTECA DE cdna É um arranjo de cópias de cdna que representa uma população de mrnas. Objetivo é gerar ESTs (Expressed Sequence Tags) que mostrem os genes expressos É o primeiro passo para identificar os genes expressos em larga escala e construção de bancos de dados BIBLIOTECA SUBTRATIVA Identificar genes diferencialmente expressos

11 ETAPAS PARA CONSTRUÇÃO DA BIBLIOTECA DE cdna 1. Isolamento do RNA 2. Síntese do cdna 3. Clonagem dos fragmentos 4. Estocagem dos clones 5. Sequenciamento 6. Análise: Bioinformática

12

13 METODOLOGIA 4. Clonagem das ESTs em vetor de transformação de bactéria ESTs geradas a partir da biblioteca subtrativa de cdna Vetor PGem-T Easy Transformação com E. coli linhagem Topo 10F (Eletroporação) Células recuperadas em meio LB líquido Plaquedas em meio LB Ampicilina(100 ug/ml) + x-gal e IPTG ( incubadas a 37 C por 16 horas)

14 METODOLOGIA 5. Sequenciamento de DNA e análise Clones Plataforma de Sequenciamento da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Chromas 2 / BioEdit Sequências comparadas (BLASTn ) Cotton Genome Database:

15 Análise das sequências - Chromas Região de qualidade alta Picos bem definidos e grandes Linha de base boa Distância entre picos anterior e posterior constante

16 Análise das sequências - Chromas Região de qualidade média poucas ambiguidades Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho médio Linha de base boa e razoável Distância entre picos anterior e posterior razoável

17 Análise das sequências - Chromas Região de qualidade ruim baixa confiabilidade Picos mal definidos e de tamanho pequeno Linha de base confusa Distância entre picos anterior e posterior inconstante

18 Análise das sequências - BioEdit

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20

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22 RESULTADOS ESPERADOS Construir uma biblioteca subtrativa de botão floral; Prospectar genes diferencialmente expressos; Validar a expressão tecidual; Auxiliar na busca de promotores tecido-específicos

23 CRONOGRAMA

24 ORÇAMENTO

25 AGRADECIMENTOS

26 -Morganna Pollynne- Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Agronomia Melhoramento Genético de Plantas da UFRPE

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