CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA DE cdna DE FIBRAS DE ALGODÃO E ANÁLISE IN SILICO DE UM DOS CLONES ISOLADO

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1 CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA DE cdna DE FIBRAS DE ALGODÃO E ANÁLISE IN SILICO DE UM DOS CLONES ISOLADO Taciana de Carvalho Coutinho (UFRN / tacycoutinho@yahoo.com.br), Wagner Alexandre Lucena (Embrapa Algodão), Kátia Castanho Scortecci (UFRN); Marcia Soares Vidal (Embrapa Algodão). RESUMO - As fibras de algodão são células tubulares únicas que se desenvolvem a partir da diferenciação da epiderme celular do tegumento do óvulo, dando origem ao fruto. Além de serem uma das mais importantes fibras naturais do grupo têxtil, as fibras do algodão fornecem um excelente sistema experimental para o estudo celular e desenvolvimental da parede celular. Este trabalho teve interesse no isolamento de genes expressos em fibra de algodão. Esta pesquisa isolou vários fragmentos de cdnas de uma biblioteca de cdna construída com fibras coletadas de 25 dias pós antese, alguns destes foram anteriormente descritos em fibras de algodão, como a proteína arabinogalactana (AGP) e a proteína de transferidora de lipídeo (LTP), mas outras não foram. Um destes clones, B05, apresentou uma alta homologia com um membro da família 47 das glicosiltransferase, estas proteínas estão envolvidas na biosíntese da parede celular. Resultados preliminares indicaram que vários clones obtidos neste trabalho são associados a proteínas da parede celular, enzimas modificadoras de parede e proteínas de transferência de lipídeo, envolvidas diretamente no desenvolvimento da fibra. Palavras-chave: Gossypium hirsutum L., expressão gênica, glicosiltransferases COTTON FIBER cdna LIBRARY CONTRUCTION AND IN SILICO ANALYSIS OF AN ISOLATED CLONE ABSTRACT - Cotton fiber is a tubular single cell trichomes derived from individual epidermal cells of the outer integument of the ovules in the developing cotton fruit. In addition to being the most important natural textile fiber crop, cotton fibers provide an excellent experimetal system to study cellular and development of cell wall. This work was concerned with the isolation of genes expressed in cotton fiber. This reaserch isolated several cdnas fragments from a cdna library constructed with fiber collected from 25 days post anthesis seeds, some of them were previously described in cotton fiber, as arabinogalactan protein (AGP) and lipid transfer protein (LTP), but others were not. One of these clones, B05, presented high homology with a member of glycosyl transferase family 47, this proteins are involved in cell wall biosynthesis. Preliminary results indicate that several clones obtained in this work are associated to cell wall proteins, wall loosing enzymes and lipid transfer proteins, all of them directly involved in fiber development. Key words: Gossypium hirsutum L., gene expression, glyclosyl transferases

2 INTRODUÇÃO O melhoramento genético do algodoeiro, assim como outras culturas agronomicamente importantes, tem sido uma preocupação constante, uma vez que nenhuma cultura preenche todos os parâmetros agronômicos qualitativos. Atualmente, o melhoramento do algodão vem sendo realizado por métodos convencionais de cruzamentos clássicos, utilizando a variação natural, o que diminui a ocorrência de caracteres desejáveis que não se encontrassem no grupo genético do algodão. O desenvolvimento de sistemas eficientes de transformação e regeneração de plantas ao longo dos anos vem criando novas possibilidades para o melhoramento vegetal em diversas espécies. As fibras do algodão são células únicas de tricoma que se desenvolvem a partir da diferenciação da epiderme celular do tegumento do óvulo, dando origem ao fruto (SONG e ALLEN, 1997). Morfologicamente, cada fibra é uma célula epidérmica que sofre expansão esférica e protrusão sobre a superfície ovular (RUAN e CHOUREY, 1998). Durante a diferenciação celular da fibra, verificam-se diferentes estágios. A fase de iniciação, ocorre de -3 a 3 dias pós-ântese, na qual 30% da epiderme celular do óvulo começa a aumentar e alongar-se rapidamente (LI et al., 2002). No período de elongação (5-25 dias pós-ântese) as células apresentam vigorosa expansão com picos de crescimento maior de 2 mm/dia. A formação da parede celular primária é composta principalmente de celulose, hemicelulose, pectinas, proteínas e ceras. A terceira fase é da formação da parede celular secundária (20 45 dias pós-ântese) onde ocorre principalmente a biosíntese e deposição de celulose. O estágio final de maturação (45 50 dias pós-ântese) está associado com o acúmulo de minerais e decréscimo no teor de água, resultando na fibra madura (JI et al., 2003). Em algodão, o melhoramento das propriedades físicas e químicas das fibras tem sido obtido por várias estratégias, inclusive pela modificação nos genes correspondentes ou pela introdução de genes de outros organismos, como bactérias, animais e plantas. Em 1996, John e Keller, relatam a obtenção de fibras de algodão expressando os genes phaa, phab e phac de Alcaligenes eutrophus, envolvidos na biosíntese de polihidroxibutirado, alterando assim algumas propriedades térmicas da fibra. Eles verificaram que as fibras retinham mais o calor, desde modo podendo ser empregadas em vestimentas de inverno. Outro relato sobre modificação de características das fibras via transgenia ocorreu em 2004, quando Li e colaboradores empregando agora os genes acsa e acsb, envolvidos na síntese de celulose em Acetobacter xylinum, obtiveram plantas de algodão cujas fibras apresentaram características superiores para o comprimento, qualidade e conteúdo de celulose na fibra. Para a transformação do algodão se faz necessário não só genes que possam alterar as características da fibra, como também, o isolamento de genes tecido-específicos, e quando se fala na modificação de características das fibras, vários pontos são relevantes, mas um dos principais é a existência de seqüências regulatórias específicas de fibras e que se preferências haja durante todas as fases necessárias para a sua expressão. Diante desta demanda, o presente trabalho focaliza, inicialmente, o isolamento de genes preferencialmente expressos em fibra de algodão, para que se possa obter um conhecimento prévio de alguns desses genes envolvidos no mecanismo regulatório do crescimento e desenvolvimento das fibras de algodão.

3 MATERIAL E MÉTODOS Plantas de algodão (Gossypium hirsutum L., cultivar CNPA ITA 90 II) foram utilizadas para a coleta de fibras de algodão em diferentes estágios de desenvolvimento (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40 Dias Pós-Ântese). As amostras coletadas foram submetidas à extração de RNA, utilizando-se dois protocolos. O primeiro protocolo foi o de isolamento do RNA genômico utilizando o reagente Trizol de acordo com o protocolo, onde se utilizou tecido vegetal das diferentes fases de desenvolvimento da fibra e dos tecidos de folha, caule e raiz. Para o segundo foi utilizado o Mini Protocolo RNeasy para isolamento de RNA total para células de plantas, tecidos e fungos filamentosos, a extração foi realizada de acordo com o fabricante do Kit, utilizando-se apenas fibras de algodão com 25 dias de desenvolvimento. As amostras de RNAs extraídas foram submetidas a quantificação em gel de agarose [agarose 0,7%, tampão TBE 0,5X (Tris-Borato 0,045 mm, EDTA 0,001 M ph8,0) e corado com Brometo de Etídeo (0,012 mg/ml)], utilizando como parâmetro o marcador de peso molecular lambda digerido com PstI. As amostras isoladas com o Mini Protocolo RNeasy foram quantificadas em gel de agarose da mesma maneira descrita acima e, analisadas também no espectrofotômetro no comprimento de onda de 260 nm. A partir dos RNAs extraídos foi iniciado a construção das bibliotecas de cdnas de fibras utilizando-se o Kit BD Creator Smart cdna Library Construction (Clontech) de acordo com as condições descritas pelo fabricante. As etapas de construção da biblioteca foram as seguintes: (I) Síntese da primeira fita do cdna; (II) Amplificação do cdna pela LD PCR; (III) Digestão com proteinase K; (IV) Digestão com SfiI; (V) Fracionamento do cdna; (VI) Ligação da dupla fita de cdna no Vetor pdnr-lib; (VII) Transformação do plasmídeo recombinante em Escherichia coli. A biblioteca foi avaliada pelo plaqueamento de 50 µl das células eletroporadas com o produto das ligações A, B e C em placas contendo o meio LB suplementado com 25 mg/l do antibiótico cloranfenicol e 0,8 mg/l de X-Gal, responsável pela seleção das bactérias que receberam o plasmídeo. Após a seleção das bactérias, estas foram crescidas em meio Circle grow com 25 mg/l de cloranfenicol, para posterior extração de DNA plasmidial. Os DNAs obtidos foram submetidos a digestões com a enzima de restrição BamHI para a seleção de clones. Uma vez com os clones confirmados, estes foram submetidos à reação de seqüenciamento utilizando o sequenciador MEGABASE, com o kit recomendado pelo fabricante (AmershamBioscience), empregando o oligonucleotídeo M13 reverso. Uma vez obtidas as seqüências, estas foram analisadas para verificar em primeiro a homologia com outras seqüências disponíveis em bancos de dados e o possível quadro de leitura da proteína putativa, assim como a presença de domínios funcionais quando de posse de uma seqüência conhecida. Para isto serão utilizadas as ferramentas de bioinformática disponíveis nos sites do NCBI, Expasy e Infobiogene.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Para a extração de RNA total de fibra e outros tecidos de algodão utilizando-se o reagente Trizol, verificou-se que as fases de desenvolvimento da fibra com 5, 10 e 15 DPA foi possível observar a presença de moléculas de RNA um pouco degradadas, enquanto que, na fase de 35 DPA simplesmente verifica-se um rastro de RNA altamente degradado. No restante das fases 20, 30 e 40 DPA não foi possível verificar a presença de moléculas de RNA, indicando que o protocolo de extração de RNA ora empregado não foi satisfatório. Como os resultados obtidos para a extração de RNA empregando o reagente Trizol não foram tão eficientes, optouse pela utilização do Kit Mini protocolo RNeasy, onde foram empregadas fibras com 25 dias de desenvolvimento, obtendo-se RNA de boa qualidade e com quantidade suficiente para a construção da biblioteca de cdna. Os clones positivos foram então submetidos a reações de sequenciamento, que revelaram a presença de genes cuja expressão já foi descrita em fibras de algodão, como por exemplo: os genes Fb8 (AF531368), FbLate-2 (U34401) e Fb34 (AY429438) de G. barbadense; o gene que codifica a proteína arabinogalactana (AY218846) de Gossypium hirsutum; o gene da proteína LTP (1-2 lipid transfer protein) (AF044204) de G. hirsutum cultivar Siokra. Ainda durante o processo de análise das seqüências, foi verificada a existência de um clone (B05) que compartilha identidade significativa (89%) com uma glicosiltransferase pertencente à família 47, descrita em Populus tremula x Populus tremuloides (AY935506) (ASPEBORG et al., 2005), apresentando um e-value de 2e-27. Durante a análise do alinhamento entre a proteína traduzida a partir da seqüência nucleotídica deste clone (457 nt) e a proteína descrita em Populus tremula x Populus tremuloides, foi verificado que a seqüência protéica deduzida do clone B05 utilizada no alinhamento corresponde à região C-terminal da proteína, que apresenta 412 aminoácidos (Figura 1). De acordo com esta informação, este clone deverá ser submetido a novas reações de seqüenciamento, empregando agora o oligonucleotídeo M13F, que possibilitará uma análise mais minuciosa do clone, revelando se este clone está completo ou não. >secondary cell wall-related glycosyltransferase family MRTCLWVFALVLVFGFVDGKKIERLRTERISGSAGDVLDDDPVGRLKVYV YELPSKYNKKLLQKDPRCLTHMFAAEIFMHRFLLSSPVRTLNPDEADWFY SPIYPTCDLTPMGLPLPFKSPRMMRSAIQLISSNWPYWNRTEGADHFFVV PHDFGACFHCQEEKAVERGILPLLQRSTLVQTFGRRNHVCLNEGSITIPP FAPPQKMQAHQIPPDIPRSIFVYFRGLFYDVNNDPEGGYYARGARAAVWE NFKNNPLFDISTDHPTTYYEDMQRAIFCLCPLGWAPWSPRLVEAVVFGCI PVIIADDIVLPFADAIPWEEIGVFVAEEDVPNLDTILTSIPPEVILRKQR LLANPSMKRAMLFPQPAQPGDAFHQILNGLARKLPHDRSVYLKSGQNILN WTAGPVGDLKPW >Clone B LRKQR LLANPSMKRAMLFPQPALPGDAFHQILNGLARKLPHQKSIYLKPGEKILN WTAGPVGDLKPW

5 Figura 1. Alinhamento entre a proteína GT47 de Populus tremula x Populus tremuloides e a proteína deduzida da seqüência do clone B05. Em animais, as glicosiltransferases pertencentes à família 47 (GT47) fazem parte do domínio amino-terminal das sintases de heparan, sendo responsáveis pela adição de resíduos β-1,4-glca, enquanto que o segundo domínio, pertence a família GT64, é responsável pela adição de resíduos α-1,4-glca. O homólogo em plantas apresenta um único domínio (CAZy, 2005). As glicosiltransferases juntamente com as glicosidases, compreendem um grupo de enzimas de grande importância nos processos de biosíntese e remodelagem de polímeros de carboidratos da parede celular durante diferentes estágios de desenvolvimento das plantas (ASPEBORG et al., 2005). CONCLUSÃO Este trabalho possibilitou o isolamento de alguns clones de cdna de fibras de algodão. A informação gerada a partir destes clones poderá ser empregada no isolamento de promotores fibra específicos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ASPEBORG, H.; SCHRADER, J.; COUTINHO, P. M. et al.; Carbohydrate-active enzymes involved in the secondary cell wall biogenesis in hybrid Aspen. Plant Physiology, v. 137, p , Disponível em < Acesso: 13 de Junho de JI, S. J.; LU, Y. C.; FENG, J. X.; WEI, G.; LI. J.; SHI, Y. H.; FU, Q.; LIU, D.; LUO, J. C. e ZHU, Y. X. Isolation and analyses of genes preferentially expressed during early cotton fiber development subtractive PCR and cdna array. Nucleic Acids Research, v. 31: p , LI, X. B.; CAI, L.; CHENG. N. H.; LIU, J. W. Molecular characterization of the cotton GhTUB1 gene that is preferentially expressed in fiber. Plant Physiology, v. 130, p , LI, X.; WANG, X. D.; ZHAO, X.; DUTT, Y. Improvement of cotton fiber quality by transforming the acsa and acsb genes into Gossypium hirsutum L. by means of vacuum infiltration. Plant Cell Reports, v. 22, p , RUAN, Y. L.; CHOUREY, P. S. A Fiberless seed mutation in cotton is associated with lack of fiber cell initiation in ovule epidermis and alterations in sucrose synthase expression and carbon partitioning in developing seeds. Plant Physiology, v. 118, p , SONG, P.; ALLEN, R. D. Identification of a cotton fiber-specific acyl carrier protein cdna by differential display. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1351, p , 1997.