Construção de um circuito sintético para a produção de hidrogénio

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Júlia Ximenes Castro
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1 Mestrado em Biologia Molecular e Celular 2014/2015 Manipulação de DNA e Biologia Sintética Construção de um circuito sintético para a produção de hidrogénio Ficha Teórico-Prática O presente plano de trabalhos pretende demonstrar as potencialidades da biologia sintética para o desenho e construção de circuitos biológicos, para os mais diversos fins biotecnológicos. Os circuitos a serem desenhados seguem a filosofia da modularidade e padronização de fragmentos de ADN (partes), desenvolvida pela BioBrick Foundation. Neste trabalho, algumas dessas partes serão obtidas de um repositório de livre acesso, criado pelo MIT (Massachusetts Institute of Technology, EUA). 1) Desenho do circuito (ver na última página) O presente circuito genético será composto por quatro módulos: um módulo de activador, um módulo de consumo de oxigénio, um módulo de produção de hidrogénio (hidrogenase) e um módulo de maturação da hidrogenase. 1.1) Caracterização das partes - Aceder à base de dados do MIT ( e inserir o código de cada uma das partes indicadas em baixo no motor de busca (canto superior direito) e proceder à sua identificação. BBa_R0040, BBa_R0062, BBa_I712074, BBa_B0034, BBa_B0015, BBa_E0040, BBa_C0062, BBa_E1010, BBa_E0020 e BBa_K No caso de a parte corresponder a um promotor, indicar os factores (proteínas ou moléculas) que afectam a sua actividade. 1.2) Preenchimento do esquema Preencha o esquema do circuito em anexo usando as partes identificadas (no ponto 1.1) e respectivos reguladores, de forma a obter um sistema funcional. 1

Os circuitos a serem desenhados seguem a filosofia da modularidade e padronização de fragmentos de ADN (partes), desenvolvida pela BioBrick Foundation.

2 2) Construção dos módulos (usando o software GENtle) Abrir o software 2.1) Criar grupo de enzimas de restrição a) no menú Tools seleccionar Enzyme management b) abre-se a janela Enzyme editor e no campo Enzymes in group seleccionar as enzimas: EcoRI, XbaI, PstI, SpeI e adicioná-las a Current enzymes clicando no botão Add. Após adicionar as 4 enzimas, clicar em Add as new group, dar o nome SB ao grupo. 2.2) Módulo de activador - Construção Este módulo é constituído por 4 partes: promotor P tet, RBS, gene luxr e o duplo terminador. O primeiro passo será a criação in silico das partes, ou seja, a criação de 4 plasmídeos, o primeiro contendo a sequência do promotor, o segundo a sequência do RBS, o terceiro a sequência de gene luxr e o quarto a sequência do terminador ) Criação de ficheiro com a sequência do vector psb1a3 a) aceder ao registo - e no motor de busca inserir psb1a3. b) na página do vector obter a sequência clicando em get selected sequence, seleccionar e copiar a sequência (Ctrl+C) c) no menú File seleccionar enter sequence d) na janela enter or paste a sequence, no campo title escrever psb1a3 e no campo abaixo colar a sequência do plasmídeo. Carregar na tecla OK e a molécula é carregada no programa aparecendo o esquema do vector e) para transformar a sequência linear numa sequência circular, escolher o menu view e depois toggle linear/circular f) clicar com o botão do lado direito do rato sobre o esquema do vector aparece um menú, escolher a opção Edit sequence. Abre-se janela Sequence editor, e em seguida 2

adicioná-las a Current enzymes clicando no botão Add. Após adicionar as 4 enzimas, clicar em Add as new group, dar o nome SB ao grupo. 2.

3 selecionar o sub-menú restriction enzymes (2). Nesta janela, selecionar as opções use these enzyme settings, use enzymes that cause 3 overlap, e no fundo da janela em use enzyme group selecionar o grupo SB (grupo de enzimas que criaram). No final clicar em OK, no esquema do plasmídeo aparecerão assinalados apenas os locais de corte das enzimas EcoRI, XbaI, PstI, SpeI. d) gravar ficheiro do vector psb1a3, para isso no menú File seleccionar Store, e clicar em Save. Este ficheiro do vector (psb1a3) será então utilizado para a criação in silico das partes seguindo as instruções dadas no ponto ) Criação de partes in silico a) no menú File seleccionar Open file b) na janela Open, seleccionar psb1a3 (carregar na tecla enter). c) aceder ao registo - e inserir o código do promotor - R no motor de busca. d) na página do promotor obter a sequência clicando em get selected sequence, seleccionar e copiar a sequência (Ctrl+C) e) (no GENtle) no menú View seleccionar Edit mode e colar a sequência (Ctrl+V) f) sair do Edit mode (F2) e seleccionar a sequência do promotor. No menú Edit escolher Selection as new feature. Na janela Sequence editor alterar o Name e Type da sequência, no final clicar em add feature. g) No menú File seleccionar Store, dar o nome ptet ao ficheiro e gravar. Repetir este processo para as partes restantes RBS (para o RBS escolher o tipo undefined), luxr e terminador ) Montagem do módulo de activador Após criar as partes é necessário proceder à sua montagem de modo a obter um módulo funcional. Seguindo a filosofia dos BioBricks é possível fazer a montagem das partes 3

No final clicar em OK, no esquema do plasmídeo aparecerão assinalados apenas os locais de corte das enzimas EcoRI, XbaI, PstI, SpeI.

4 utilizando para esse efeito os locais de corte: EcoRI, XbaI, SpeI e PstI. Quando se faz a montagem dos módulos in silico é preciso ter em conta que esta será uma estratégia de biologia molecular a aplicar na prática; querendo isto dizer que a clonagem das diversas partes não é aleatória ) clonagem do luxr no vector contendo o RBS. a) Seleccionar o ficheiro da parte RBS: no menú File seleccionar Open file, na janela Open selecionar a molécula que se pretende abrir. b) No menú Tools seleccionar Enzyme assistant, abre-se a janela Restriction assistant. No campo Available enzymes escolhem-se as enzimas que se pretende utilizar na digestão, que neste caso vão ser: SpeI e PstI. As enzimas são seleccionadas uma a uma e adicionadas ao campo Cocktail pressionando o botão Add to cocktail, depois de selecionadas as enzimas clicar no botão Start restriction. Obtem-se assim o plasmídeo digerido onde se irá clonar o fragmento contendo o luxr. c) O fragmento luxr será obtido por digestão do respectivo plasmídeo com XbaI e PstI. Para isso basta seguir o protocolo utilizado para a digestão do RBS, tendo que ter em atenção que na janela Restriction assistant será necessário remover a enzima SpeI do campo Cocktail. Para esse efeito basta selecionar a enzima no campo cocktail e clicar no botão Remove enzyme. Não esquecer de adicionar a enzima XbaI Após digestão deste plasmídeo vão ser obtidos dois fragmentos um contendo o luxr e o outro o resto do plasmídeo. Este último fragmento não vai ser necessário e deve portanto ser eliminado, para isso carregar com o botão direito do rato sobre o fragmento (que se encontra disponível na janela do lado esquerdo) e fazer close. d) Temos então dois fragmentos cortados com enzimas de restrição, o passo seguinte será ligar o frag. luxr ao plasmídeo contendo o RBS. No menú Tools seleccionar Ligation. Abre-se a janela Ligation onde mostra os fragmentos a serem ligados (campo da esquerda) e as construções a serem criadas, neste último campo temos de seleccionar a construção pretendida - RBS (PstI/SpeI)-luxR (XbaI/PstI) e clicar no botão Ligate!. e) No menú File seleccionar Store, dar o nome RBS-luxR ao ficheiro e gravar. 4

não é aleatória. 2.2.3.1) clonagem do luxr no vector contendo o RBS.

5 ) Clonar o fragmento RBS-luxR no vector contendo o promotor P tet, construção que devem designar como P tet -RBS-luxR ) Clonar o fragmento P tet -RBS-luxR no vector contendo o terminador, construção que devem designar como Activador ) Montagem do módulo consumidor de oxigénio contendo gene repórter GFP (opcional) ) montagem do módulo consumidor de oxigénio que é constituido por: P luxr, RBS, gene ATF, RBS, GFP e o terminador (TT). O repórter será clonado após o módulo consumidor de oxigénio, o que permitirá monitorizar o funcionamento do mesmo através da detecção da GFP. Nota: ficheiro do gene ATF será disponibilizado por ) Montagem do circuito O circuito final será constituído pelos módulos: activador, consumo de oxigénio, maturação e produção de hidrogénio. Os ficheiros dos módulos de maturação e produção de hidrogénio serão disponibilizados por . 3) Previsão do comportamento do sistema Tendo em consideração o modelo construído, preveja o comportamento do sistema, desenhando dois gráficos da intensidade de fluorescência das proteínas repórter em função do tempo, com e sem a adição do inibidor do repressor. 5

O repórter será clonado após o módulo consumidor de oxigénio, o que permitirá monitorizar o funcionamento do mesmo através da detecção da GFP.

6 1. Esquema do circuito Mód. activador gene 1 molécula 2 molécula 1 Hidrogenase Mód. maturação hidrogenase P 1 P 3 Mód. consumidor de O 2 P 2 ATF Repórter 1 P 2 hydef hydg gene 2 Repórter 2 hyda1 gene 3 Repórter 3 6

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