Clonagem Molecular. Esta tecnologia permite estudar os genes e os seus produtos, obter organismos transgênicos e realizar terapia gênica.

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2 Clonagem Molecular A clonagem molecular é o processo de construção de moléculas de DNA recombinante e da sua propagação em hospedeiros apropriados que possibilitam a selecção do DNA recombinante. Esta tecnologia permite estudar os genes e os seus produtos, obter organismos transgênicos e realizar terapia gênica.

3 Clonagem Molecular Isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas Origem do termo: cada colônia bacteriana é um clone Tecnologia do DNA recombinante Produção de proteínas em larga escala Construção de bibliotecas genômicas e de cdna

4 Clonagem Molecular

5 Clonagem Molecular Duas etapas principais inserto vetor 1. Ligação do fragmento de DNA em um plasmídeo DNA recombinante 2. Introdução do DNA recombinante numa células hospedeira compatível Transformação

6 Enzimas de restrição Naturalmente produzidas por bactérias Mecanismo de defesa à entrada de DNA exógeno Sequencias 4 nt 6 nt 8 nt São denominadas por abreviaturas das estirpes bacterianas a partir das quais foram isoladas. AluI 1ª enzima de restrição a ser isolada de Arthrobacter luteus.

7 Enzimas de restrição Capacidade de clivar o DNA em regiões específicas Palindrômicas quando lidas na mesma orientação em ambas as cadieas 5 3 ou 3 5 são identicas enzimas com extremidades coesivas Blunt-end Extremidade coesiva

8 Enzimas de restrição Digerir ou cortar DNA Reconhecem sequencia de bases específica cliva o DNA toda vez que a sequencia GAATTC for encontrada Importante ferramenta clonar DNA de interesse n o fragmentos n o sítios de restrição Mapa de restrição - caracterização da molécula de DNA

9 Digestão do DNA com enzimas de restrição DNA + U enzima de restrição (37 o C, ou outra temperatura)

10 Digestão e ligação ligase Quando DNAs de organismos diferentes são digeridos com mesma enzima passam a apresentar extremidades coesivas compatíveis (clivados em regiões contendo a mesma sequencia de nucleotídeos) Formar moléculas híbridas DNA de dois organismos (genotecas ou moléculas de DNA recombinante)

11 Clonagem construção molécula híbrida

12 Clonagem construção molécula híbrida

13 Clonagem construção molécula híbrida

14 Vetor de clonagem - Plasmídeo Todo plasmídeo para ser um bom vetor de clonagem deve ter: Origem de replicação (Ori) Múltiplos sítios de clonagem (poly linker) Resistência a antibiótico (Amp, Kan, etc) * Extra: gene da b-galactosidase (lacz)

15 Transformação em células competentes Células competentes Células bacterianas quimicamente modificadas para receberem o DNA recombinantes

16 Introdução molécula recombinante célula hospedeira

17 Seleção de colônias Resistência a antibiótico Expressão de b-galactosidase Fragmento de DNA é inserido no meio do gene lacz b-gal: degrada polissacarídeos X-gal: substrato cromogênico forma precipitado azul quando há atividade de b-gal IPTG: indutor da atividade de b-gal

18 Screening de colônias Mini-prep Isolamento do plasmídeo e corte com enzimas de restrição + enzimas de restrição PCR de colônia PCR com primers específicos do inserto Mini prep PCR colônia

19 Transformação X Transfecção

20 Transformação X Transfecção Definições: Transformação e Transfecção Transformação: -Modificação de um genoma pela aplicação externa de DNA de uma célula de genótipo diferente - conversão de células eucarióticas normais em células em estado tumoral (com divisão descontrolada) Transfecção: - Introdução de ácidos nucléicos em células eucarióticas utilizando vetor viral ou plasmídeo Transformação: - Introdução de ácidos nucleicos em procariotos

21 Vetores de clonagem Tipos de vetores mais encontrados Plasmídeos (mais comuns) até 20 kb Fago lambda até 25 kb Cosmídeos 35 a 45 kb

22 Plasmídeos Plasmídeos presentes em grande número de cópias Regiões: - origem de replicação - múltiplos sítios de clonagem - gene de resistência a antibiótico

23 Vetores ou plasmídeos Clonagem, expressão, produção proteina recombinante Clonagem e obtenção de sonda molecular

24 Fago l Empacotamento in vitro eficiencia 10% - sítio cos (vetores de substituição) Infecção E. Coli eficiencia 100% (vetores de inserção)

25 Cosmídeos Plasmídeos com um fragmento de DNA do fago l sítio cos Utilizam sistema de empacotamento in vitro do fago l Tornam-se circulares na células hospedeira Permitem clonagem de genes maiores 35 a 45 kb

26 Vetores de expressão Plasmídeos cujo inserto deverá ser expresso numa proteína Amplamente utilizados na pesquisa e em terapias atuais

27 Vetores para expressão de proteína recombinante Vetores com 3 fases de leitura ORF GAA TTC ATG GGG TCG CTT AAG TAC CCC AGC INSERTO AA TTC ATG GGG TCG G TAC CCC AGC GAA TTC CCG GGT CTT AAG GGC CCA Vetor pgex 4T-1 G CTT AA GAA TTC ATG GGG TCG CTT AAG TAC CCC AGC

28 Fase de leitura aberta - ORF Vetores com 3 fases de leitura ORF GAA TTC ATG GGG TCG CTT AAG TAC CCC AGC INSERTO AA TTC ATG GGG TCG G TAC CCC AGC GGA ATT CCC GGG CCT TAA GGG CCC Vetor pgex 4T-2 GG CCT TAA GGA ATT CAT GGG GTC G CCT TAA GTA CCC CAG C

29 Fase de leitura aberta - ORF Vetores com 3 fases de leitura ORF GAA TTC ATG GGG TCG CTT AAG TAC CCC AGC INSERTO AA TTC ATG GGG TCG G TAC CCC AGC TGG AAT TCC CGG G ACC TTA AGG GCC C Vetor pgex 4T-3 TGG ACC TTA A TGG AAT TCA TGG GGT CG ACC TTA AGT ACC CCA GC

30 Clonagem direcionada Eco RI Eco RI Eco RI Sal I não direcionada direcionada

31 Proteína de fusão, sítio de clivagem e stop codons GST Trombina Eco RI Sal I Stop codons

32 Construção de bibliotecas DNA genomico mrna sequencias expressas Fragmentar aleatoriamente (enzimas restrição reduz representatividade) Mecanicamente ou digerido DNAse I Transcrição reversa (oligo dt ) Síntese de cdna Reparo das extremidades blunt end Adição de adaptadores contendo sítio para enzima

33 Construção de bibliotecas + Eco RI + Eco RI Clonagem, expressão produção proteina recombinante Sequenciamento de nt Clonagem de tamanhos fragmentos específicos Clonagem produtos PCR Ligação Hibridização Expressão

34 Seleção de fragmento de DNA com capacidade de expressar um antígeno recombinante específico Aumento da sensibilidade e especificidade do teste sorológico Screening imunológico

35 Purificar e expandir clone recombinante em bactéria Clone imunoselecionado Subclonagem e produção da proteína recombinante em larga escala - ORF Crescimento da bactéria recombinante Indução da expressão do gene - IPTG Purificação da proteína recombinante Coluna de afinidade

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