Enzimas e Clonagem Molecular

Transcrição

1 Universidade Estadual de Maringá Enzimas e Clonagem Molecular Disciplina: Biologia Molecular 6855 Profa. Dra Maria Aparecida Fernandez

2 Enzimas: Enzimas de Restrição Endonucleases de restrição; Fazem o reconhecimento de uma sequência específica do DNA e cortam ambas as fitas da hélice em lugares determinados; Encontradas em procariotos; Só agem em DNA exógeno: sítio de reconhecimento da enzima é metilado; Enzima reconhece sequência de 4 a 8 pb e hidrolisa ligação fosfodiéster em cada fita (Sítio de Ligação);

3 Enzimas: Enzimas de Restrição Sítios de clivagem ou sítios de restrição: Possuem sequência de reconhecimento palindrômica;

4 Enzimas: Enzimas de Restrição

5 Enzimas: Enzimas de Restrição Nomenclatura: - Abreviação de 3 letras do nome da espécie (1); - Designação da linhagem (se necessário) (2); - Número romano, caso seja for produzida mais de uma enzima de restrição pela espécie (3). Ex: Escherichia coli RY13: EcoRI 1 2 3

6 Enzimas: Enzimas de Restrição Podem gerar extremidades coesivas ou extremidades cegas: +

7 Enzimas: DNA ligase Fragmentos de DNA com extremidades coesivas ou cegas por ser unidas pela DNA ligase; Catalisa a formação de uma ligação fosfodiéster entre duas moléculas; Requer grupamento 3 -OH livre em uma das cadeias e um grupamento 5 -P na outra;

8 Enzimas: DNA ligase Adenilação do res. lisina da ligase (Ativa) Adenila 5 -P (Ativo) Sofre ataque nucleofílico de 3 -OH Formação da ligação fosfodiéster + AMP

9 Enzimas de Modificação do DNA Modificam o DNA pela adição ou remoção de grupamentos químicos: - Fosfatase alcalina; - Polinucleotídeo quinase; - Desoxinucleotidil-terminal-transferase; - DNA-polimerases: I - Fragmento de Klenow; - DNA polimerases termoestáveis; - Transcriptases reversas.

10 Fosfatase alcalina Fosfatases alcalinas utilizadas em biologia molecular são produzidas em E. coli, tecido intestinal bovino ou camarão do ártico; Remove o grupamento fosfato da extremidade 5 de uma molécula de DNA:

11 Polinucleotídeo quinase Enzima extraída de E. coli infectadas pelo bacteriófago T4 (Possui o gene codificador da enzima); Atua inserindo grupamentos fosfatos na extremidade 5 livres de uma molécula de DNA (fosfato do ATP):

12 Desoxinucleotidil-terminal-transferase Extraída de tecido de timo bovino; Adiciona um ou mais desoxirribonucleotídeos às extremidades 3 -OH de uma molécula de DNA Fita simples (I) ou dupla (II):

13 DNA-polimerases DNA-polimerase I: Liga-se a uma região fita simples curta, de uma molécula de DNA fita dupla, e sintetiza uma fita totalmente nova, degradando existente a medida que prossegue a polimerização; Fragmento Klenow: Modificação da DNA-polimerase I (Sem porção catalítica). Ela é capaz de sintetizar uma fita de DNA complementar ao molde (utilizada no sequenciamento pelo método de Sanger);

14 DNA-polimerases DNA-polimerases termoestáveis: *Ex 1 : Taq-DNA-polimerase: - Extraída de Thermus aquaticus; - Resiste a denaturação pelo calor; - Não realiza revisão; - Utilizada no método de PCR *Ex 2 : Pfu-DNA-polimerase: - Extraída de Pyrococcus furiosus; - Possui atividade exonucleásica 3 5 ; - Menor taxa de erro na síntese do DNA (alta fidelidade); - Taxa de erro inferior a 2,6 x 10-6.

15 DNA-polimerases Transcriptases reversas: - São DNA-polimerases RNA-dependentes envolvidas na replicação de vários vírus; - Utilizam o RNA como molde para sintetizar uma fita de DNA complementar (cdna); - Útil para construção de bibliotecas de cdna a partir de amostras específicas de mrna.

16 Clonagem Molecular Inserto; Vetor; DNA recombinante; Transformação; Transformantes;

17 Clonagem Molecular

18 Clonagem Molecular: Vetores Devem ter a capacidade de replicar na célula hospedeira (Replicação autônoma); Devem possuir sítios de clonagem; Tamanho deve ser pequeno (menos de 10 Kb); Exemplos de vetores de clonagem: - Plasmídeos; - Bacteriófago λ; - Cosmídeos; - BACs; - YACs.

19 Clonagem Molecular: Plasmídeos São derivados de plasmídeos de organismos procarióticos ou eucarióticos unicelulares; São moléculas de DNA circular, fita dupla, extracromossômicas, com capacidade de replicação autônoma; São modificados pela engenharia genética; Alguns aumentam o número de cópias dentro da célula hospedeira, transportam genes que conferem resistência á antibióticos.

20 Clonagem Molecular: Plasmídeos puc18: Gene que codifica resistência a ampicilina, origem de replicação e o gene lacz e vários sítios de clonagem que inativam o gene lacz

21 Clonagem Molecular: Plasmídeos puc18 e puc19 possuem a mesma região contendo os sítios de clonagem, mas com orientação oposta; Bactérias contendo plasmídeos recombinantes são selecionados pela coloração branca da colônia; Bactérias contendo plasmídeos selvagens são selecionados pela coloração azul da colônia (βgalactosidade ativa);

22 Clonagem Molecular: Bacteriófago λ Os fagos são considerados elementos genéticos móveis e são utilizados como vetores por possuírem replicação autônoma; Bacteriófago λ foi modificado por engenharia genética; Segmentos de DNA podem ser inseridos no genoma viral e introduzidos dentro de uma célula viral por trasfecção; Fago infectivo in vivo: Formado por capsídeo, cauda e DNA;

23 Clonagem Molecular: Bacteriófago λ Para o empacotamento do DNA viral devem ser formados concactêmeros; Os genomas são separados pela clivagem nos sítios cos (coesivas); Os sítios cos (12 pb) devem se repetir a cada 35 a 50 kb para ocorrer empacotamento do DNA na forma de uma partícula infectiva; Segmento stuffer, não é necessário para que o fago infecte uma célula, portanto pode ser substituído por um DNA exógeno;

24 Clonagem Molecular: Bacteriófago λ Derivado do bacteriófago λ: λembl 4 contém sítios de clivagem para enzimas de restrição, flanqueando um stuffer de 14 kb; Stuffer pode ser removido por clivagem. O DNA remanescente pode ser ligado ao fragmento de DNA de interesse, gerando genomas recombinantes; Insertos de 9 a 23 kb (depende do vetor); As partículas de fagos contendo moléculas recombinantes podem ser introduzidas na célula hospedeira por infeccção;

25 Clonagem Molecular: Bacteriófago λ

26 Clonagem Molecular: Cosmídeos Plasmídeos permitem clonagem de fragmentos de poucas centenas até 9 kb; Cosmídeos permitem clonagem de fragmentos maiores; Cosmídeos: São plasmídeos com as sequências cos do bacteriófago λ; Clonagem de fragmentos grandes em cosmídeos Recombinantes Empacotados em capsídeos do bacteriófago λ Infecção de E. coli; Fosmídeos: Variação que contém a origem de replicação do plasmídeos F de E. coli, o que permite um menor número de cópias por célula hospedeira.

27 Clonagem Molecular: BACs Se baseia no plasmídeo F; Fragmentos maiores de 300 kb podem se clonados e mantidos de maneira estável na célula hospedeira; Alta eficiência de clonagem, fácil manipulação e estabilidade do fragmento clonado; Utilizado para a construção de bibliotecas genômicas.

28 Clonagem Molecular: BACs Mapa físico do pbelo11:

29 Clonagem Molecular: BACs

30 Clonagem Molecular: YACs Clonagem de fragmentos de 100 a 1000 kb; Cromossomos artificiais de levedura (Saccharomyces cerevisae); São plasmídeos com marcadores genéticos para seleção (TRP1 e NEO), contém elementos para replicação autônoma (ARS), um centrômero (CEN) e os telômeros; Utilizados para construção de bibliotecas genômicas; São mantidos em S. cerevisae.

31 Clonagem Molecular: YACs Construção de recombinantes utilizando um vetor YAC:

32 Clonagem Molecular: YACs

33 Introdução de moléculas de DNA recombinantes em células bacterianas Após clonagem de um gene em um vetor, o mesmo é reintroduzido em diferentes tipos celulares; Há produção de muitas cópias da sequência de interesse; Podem ser produzidas linhagens celulares para a superexpressão do gene, o que permite a purificação do seu produto para caracterização bioquímica ou produção em escala industrial; DNA precisa ser introduzido de maneira eficiente no interior da célula.

34 Transformação bacteriana Em 1970: Mandel e Higa trataram bactérias com Cloreto de cálcio e após as aqueceram brevemente bactérias podiam se transfectadas com DNA do bacteriófago λ; Tratamento das bactérias induz a um estado de competência, que permite que as bactérias receptores se tornem permeáveis a moléculas de DNA (Vídeo);

35 Transformação bacteriana Protocolo original: Rendem colônias transformadas por micrograma de DNA plasmidial; Eficiência pode ser melhorada 100 a 1000 vezes : - Linhagens mais suscetíveis a transformação; - Combinação de cátions divalentes por mais tempo; - Tratamento das células com diferentes compostos.

36 Transformação bacteriana Método alternativo: Eletroporação; Eficiência de transformantes por micrograma de DNA; DNA tratado em solução de baixa concentração salina; Células suspendidas em solução de glicerol 10%; DNA + células eletrocompetentes submetidas a campo elétrico de alta voltagem abertura dos poros da bactéria entrada do DNA;

37 Transfecção de Fagos Introdução de DNAs derivados de fagos em determinadas linhagens de E. coli; Fagos ligam-se a receptores protéicos na membrana da bactéria; Receptores codificados pelo gene lamb (utilizados para o transporte de maltose); Bactérias devem ser cultivadas em meio contendo maltose e ausente em glicose;

38 Transfecção com DNA de fagos

39 Seleção de transformantes Necessário identificar a célula que recebeu o plasmídeo, dentre as milhares que não o receberam; Utilização da marca de seleção contida no plasmídeo; Ex: Gene que confere resistência ao antibiótico ampicilina do puc18 (cultivo em placas contendo o antibiótico);

40 Identificação dos recombinantes Necessário fazer a identificação das colônias transformadas e quais possuem vetor vazio ou selvagem; Plasmídeos com sítio único de clivagem que quando recebe o inserto inativa um dos genes presentes no receptor (Inativação por inserção); pbr322: Resistência à ampicilina e à tetraciclina. Ocorre inativação do gene para a tetraciclina quando ocorre a inserção do DNA exógeno (clivagem com BamHI); Inoculação simultânea em ampicilina e tetraciclina.

41 Identificação dos recombinantes

42 Identificação dos recombinantes Método de identificação visual: Por meio da coloração exibida pela colônia transformante; Vetores derivados do puc18: Possuem gene para resistência a ampicilina e o gene LacZ que codifica parte da enzima β-galactosidase; Clonagem em puc19 envolve a inativação do gene LacZ : Recombinantes são incapazes de sintetizar β-gal ativa; Lactose β-gal galactose

43 Identificação dos recombinantes Gene lacz : Presente no cromossomo de E. coli; Algumas linhagens não possuem um segmento (LacZ ), que codifica parte da β-gal (subunidade α); Os mutantes só conseguem sintetiza a β-gal funcional quando possuem um plasmídeo como o puc18; Seleção feita em meio sólido contendo: ampicilina, X-gal e IPTG;

44 Identificação dos recombinantes X-gal: Análogo da lactose que degradado pela β-gal ativa produz um composto que confere cor azul à colônia; IPTG: Análogo da lactose não suscetível a degradação pela β-gal, utilizado para a indução da transcrição do gene lacz ;

45 Biologia Molecular Básica: Livros: Editora Artmed, 4ª Edição, Arnaldo Zaha, Henrique Bunselmeyer Ferreira e Luciane M. P. Passaglia. *Capítulo 16.1 e 16.2 Princípios de Bioquímica de Lehninger: Editora Artmed, 5ª edição, David L. Nelson e Michael M. Cox *Capítulo 09