Universidade Estadual de Maringá

Transcrição

1 Universidade Estadual de Maringá Disciplina: Biologia Molecular 6855/ Turmas 1 e 2 Enzimas de restrição/modificação do DNA e Clonagem Profa. Dra. Maria Aparecida Fernandez

2 Endonucleases de restrição; Fazem o reconhecimento de uma sequência específica do DNA e cortam ambas as fitas da hélice em lugares determinados; Encontradas em procariotos; Só agem em DNA exógeno: sítio de reconhecimento da enzima é metilado; Enzima reconhece sequência de 4 a 8 pb e hidrolisa ligação fosfodiéster em cada fita (Sítio de Ligação);

3 Stanley Cohen Plasmídeo psc101

4 Conferencia de Asilomar Pacific Grove - California USA cientistas de 17 nações - Recombinant DNA Advisory Commitee - RAC Normas para contenção biológica - P1 P4

5 W. Alber H. Smith D. Nathans

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11 Ferramentas de trabalho Enzimas de restrição Sistema restrição/modificação Tipo II - utilizadas na TDR: reconhecem seqüências específicas de nucleotídeos no DNA - palíndromos, atuam como verdadeiras tesouras moleculares Tipos de cortes: Produção de terminais coesivos (adesivos, protuberantes) Produção de terminais abruptos (ou cegos)

12 Enzima de restrição EcoRI

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16 a) Clivagem no eixo de simetria b) Clivagem fora do eixo de simetria...tc GA......AG CT......GAA TTC......CTT AAG Moléculas com extremidades abruptas Moléculas com extremidades coesivas

17 Gênero Eco RI Espécie Ordem de descoberta Linhagem Enzima Organismo Seqüência Alu I Arthrobacter luteus 5 AG CT Bam HI Bacillus amyloliquefasciens H 5 G GATCC Hae III Haemophilus aegyptius 5 GG CC Hind III Haemophilus influenzae Rd 5 A AGCTT Eco RI Escherichia coli RY13 5 G AATTC

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21 Enzimas: DNA ligase Fragmentos de DNA com extremidades coesivas ou cegas por ser unidas pela DNA ligase; Catalisa a formação de uma ligação fosfodiéster entre duas moléculas; Requer grupamento 3 -OH livre em uma das cadeias e um grupamento 5 -P na outra;

22 Enzimas: DNA ligase Adenilação do res. lisina da ligase (Ativa) Adenila 5 -P (Ativo) Sofre ataque nucleofílico de 3 -OH Formação da ligação fosfodiéster + AMP

23 Enzimas de Modificação do DNA Modificam o DNA pela adição ou remoção de grupamentos químicos: - Fosfatase alcalina; - Polinucleotídeo quinase; - Desoxinucleotidil-terminal-transferase; - DNA-polimerases: I - Fragmento de Klenow; - DNA polimerases termoestáveis; - Transcriptases reversas.

24 Fosfatase alcalina Fosfatases alcalinas utilizadas em biologia molecular são produzidas em E. coli, tecido intestinal bovino ou camarão do ártico; Remove o grupamento fosfato da extremidade 5 de uma molécula de DNA:

25 Polinucleotídeo quinase Enzima extraída de E. coli infectadas pelo bacteriófago T4 (Possui o gene codificador da enzima); Atua inserindo grupamentos fosfatos na extremidade 5 livres de uma molécula de DNA (fosfato do ATP):

26 Desoxinucleotidil-terminal-transferase Extraída de tecido de timo bovino; Adiciona um ou mais desoxirribonucleotídeos às extremidades 3 -OH de uma molécula de DNA Fita simples (I) ou dupla (II):

27 DNA-polimerases DNA-polimerase I: Liga-se a uma região fita simples curta, de uma molécula de DNA fita dupla, e sintetiza uma fita totalmente nova, degradando existente a medida que prossegue a polimerização; Fragmento Klenow: Modificação da DNA-polimerase I (Sem porção catalítica). Ela é capaz de sintetizar uma fita de DNA complementar ao molde (utilizada no sequenciamento pelo método de Sanger);

28 DNA-polimerases DNA-polimerases termoestáveis: *Ex 1 : Taq-DNA-polimerase: - Extraída de Thermus aquaticus; - Resiste a denaturação pelo calor; - Não realiza revisão; - Utilizada no método de PCR *Ex 2 : Pfu-DNA-polimerase: - Extraída de Pyrococcus furiosus; - Possui atividade exonucleásica 3 5 ; - Menor taxa de erro na síntese do DNA (alta fidelidade); - Taxa de erro inferior a 2,6 x 10-6.

29 DNA-polimerases Transcriptases reversas: - São DNA-polimerases RNA-dependentes envolvidas na replicação de vários vírus; - Utilizam o RNA como molde para sintetizar uma fita de DNA complementar (cdna); - Útil para construção de bibliotecas de cdna a partir de amostras específicas de mrna.

30 Plasmídeos Vetores Hospedeiros Bactérias / leveduras Utilização clonagem Cosmídeos Bacteriófagos Virus Células eucarióticas Terapia gênica

31 Clonagem Molecular: Plasmídeos São derivados de plasmídeos de organismos procarióticos ou eucarióticos unicelulares; São moléculas de DNA circular, fita dupla, extracromossômicas, com capacidade de replicação autônoma; São modificados pela engenharia genética; Alguns aumentam o número de cópias dentro da célula hospedeira, transportam genes que conferem resistência á antibióticos.

32 Clonagem Molecular: Plasmídeos puc18: Gene que codifica resistência a ampicilina, origem de replicação e o gene lacz e vários sítios de clonagem que inativam o gene lacz

33 Clonagem Molecular: Plasmídeos puc18 e puc19 possuem a mesma região contendo os sítios de clonagem, mas com orientação oposta; Bactérias contendo plasmídeos recombinantes são selecionados pela coloração branca da colônia; Bactérias contendo plasmídeos selvagens são selecionados pela coloração azul da colônia (β-galactosidade ativa);

34 Clonagem Molecular: Bacteriófago λ Os fagos são considerados elementos genéticos móveis e são utilizados como vetores por possuírem replicação autônoma; Bacteriófago λ foi modificado por engenharia genética; Segmentos de DNA podem ser inseridos no genoma viral e introduzidos dentro de uma célula viral por trasfecção; Fago infectivo in vivo: Formado por capsídeo, cauda e DNA;

35 Clonagem Molecular: Bacteriófago λ Para o empacotamento do DNA viral devem ser formados concactêmeros; Os genomas são separados pela clivagem nos sítios cos (coesivas); Os sítios cos (12 pb) devem se repetir a cada 35 a 50 kb para ocorrer empacotamento do DNA na forma de uma partícula infectiva; Segmento stuffer, não é necessário para que o fago infecte uma célula, portanto pode ser substituído por um DNA exógeno;

36 Clonagem Molecular: Bacteriófago λ Derivado do bacteriófago λ: λembl 4 contém sítios de clivagem para enzimas de restrição, flanqueando um stuffer de 14 kb; Stuffer pode ser removido por clivagem. O DNA remanescente pode ser ligado ao fragmento de DNA de interesse, gerando genomas recombinantes; Insertos de 9 a 23 kb (depende do vetor); As partículas de fagos contendo moléculas recombinantes podem ser introduzidas na célula hospedeira por infeccção;

37 Clonagem Molecular: Bacteriófago λ

38 Clonagem Molecular: Cosmídeos Plasmídeos permitem clonagem de fragmentos de poucas centenas até 9 kb; Cosmídeos permitem clonagem de fragmentos maiores; Cosmídeos: São plasmídeos com as sequências cos do bacteriófago λ; Clonagem de fragmentos grandes em cosmídeos Recombinantes Empacotados em capsídeos do bacteriófago λ Infecção de E. coli; Fosmídeos: Variação que contém a origem de replicação do plasmídeos F de E. coli, o que permite um menor número de cópias por célula hospedeira.

39 Clonagem Molecular: BACs Se baseia no plasmídeo F; Fragmentos maiores de 300 kb podem se clonados e mantidos de maneira estável na célula hospedeira; Alta eficiência de clonagem, fácil manipulação e estabilidade do fragmento clonado; Utilizado para a construção de bibliotecas genômicas.

40 Mapa físico do pbelo11: Clonagem Molecular: BACs

41 Clonagem Molecular: BACs

42 Clonagem Molecular: YACs Clonagem de fragmentos de 100 a 1000 kb; Cromossomos artificiais de levedura (Saccharomyces cerevisae); São plasmídeos com marcadores genéticos para seleção (TRP1 e NEO), contém elementos para replicação autônoma (ARS), um centrômero (CEN) e os telômeros; Utilizados para construção de bibliotecas genômicas; São mantidos em S. cerevisae.

43 Clonagem Molecular: YACs Construção de recombinantes utilizando um vetor YAC:

44 Clonagem Molecular: YACs

45 Introdução de moléculas de DNA recombinantes em células bacterianas Após clonagem de um gene em um vetor, o mesmo é reintroduzido em diferentes tipos celulares; Há produção de muitas cópias da sequência de interesse; Podem ser produzidas linhagens celulares para a superexpressão do gene, o que permite a purificação do seu produto para caracterização bioquímica ou produção em escala industrial; DNA precisa ser introduzido de maneira eficiente no interior da célula.

46 Transformação bacteriana Em 1970: Mandel e Higa trataram bactérias com Cloreto de cálcio e após as aqueceram brevemente bactérias podiam se transfectadas com DNA do bacteriófago λ; Tratamento das bactérias induz a um estado de competência, que permite que as bactérias receptores se tornem permeáveis a moléculas de DNA (Vídeo);

47 Transformação bacteriana Protocolo original: Rendem colônias transformadas por micrograma de DNA plasmidial; Eficiência pode ser melhorada 100 a 1000 vezes : - Linhagens mais suscetíveis a transformação; - Combinação de cátions divalentes por mais tempo; - Tratamento das células com diferentes compostos.

48 Transformação bacteriana Método alternativo: Eletroporação; Eficiência de transformantes por micrograma de DNA; DNA tratado em solução de baixa concentração salina; Células suspendidas em solução de glicerol 10%; DNA + células eletrocompetentes submetidas a campo elétrico de alta voltagem abertura dos poros da bactéria entrada do DNA;

49 Transfecção de Fagos Introdução de DNAs derivados de fagos em determinadas linhagens de E. coli; Fagos ligam-se a receptores protéicos na membrana da bactéria; Receptores codificados pelo gene lamb (utilizados para o transporte de maltose); Bactérias devem ser cultivadas em meio contendo maltose e ausente em glicose;

50 Transfecção com DNA de fagos

51 Seleção de transformantes Necessário identificar a célula que recebeu o plasmídeo, dentre as milhares que não o receberam; Utilização da marca de seleção contida no plasmídeo; Ex: Gene que confere resistência ao antibiótico ampicilina do puc18 (cultivo em placas contendo o antibiótico);

52 Identificação dos recombinantes Necessário fazer a identificação das colônias transformadas e quais possuem vetor vazio ou selvagem; Plasmídeos com sítio único de clivagem que quando recebe o inserto inativa um dos genes presentes no receptor (Inativação por inserção); pbr322: Resistência à ampicilina e à tetraciclina. Ocorre inativação do gene para a tetraciclina quando ocorre a inserção do DNA exógeno (clivagem com BamHI); Inoculação simultânea em ampicilina e tetraciclina.

53 Identificação dos recombinantes

54 Identificação dos recombinantes Método de identificação visual: Por meio da coloração exibida pela colônia transformante; Vetores derivados do puc18: Possuem gene para resistência a ampicilina e o gene LacZ que codifica parte da enzima β-galactosidase; Clonagem em puc19 envolve a inativação do gene LacZ : Recombinantes são incapazes de sintetizar β-gal ativa; Lactose galactose β-gal

55 Identificação dos recombinantes Gene lacz : Presente no cromossomo de E. coli; Algumas linhagens não possuem um segmento (LacZ ), que codifica parte da β-gal (subunidade α); Os mutantes só conseguem sintetiza a β-gal funcional quando possuem um plasmídeo como o puc18; Seleção feita em meio sólido contendo: ampicilina, X-gal e IPTG;

56 Identificação dos recombinantes X-gal: Análogo da lactose que degradado pela β-gal ativa produz um composto que confere cor azul à colônia; IPTG: Análogo da lactose não suscetível a degradação pela β-gal, utilizado para a indução da transcrição do gene lacz ;

57 Plaqueamento