Sequenciamento de genomas procariotos utilizando tecnologia de nova geração. Introdução ao sequenciamento de nova geração 4/11/14

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1 4/11/14 Aula 2 Sequenciamento de genomas procariotos utilizando tecnologia de nova geração Introdução ao sequenciamento de nova geração Ana Marcia de Sá Guimarães, Méd Vet, MSc, PhD Aula 2 Tópicos 1. Sequenciamento de segunda geração Ion Torrent SOLiD PacBio 3. Sequenciamento de quarta geração Oxford Nanopore 4. Comparações (próxima aula) Paramêtros Sanger (96 capilares) 454 (GS FLX Titanium XL+) Illumina (HiSeq 2500) Ion Proton Leitura Até pb Até 700 pb Até 150 pb Até 200 pb Acurácia 99.9% 99.9% 99% 99% Leituras por corrida Até 96 1 milhão 300 milhões a 2 bilhões 60 a 80 milhões Bases por corrida 96 mil (Kb) 700 milhões (Mb) 10 a bilhões (Gb) 10 bilhões (Gb) Tempo por corrida 8 horas 23 horas 7 horas a 6 dias 2-4 horas MIDs Custo por milhão de bases $2.400 $ 10 $ 0.15 $1 Prós Leituras longas Leituras longas Alto número de leituras Equipamento mais barato Contras - Alto custo - Impraticável para highthroughput - Custo por leitura - Equipamento - Erros em mais caro homopolímeros - Erros em homopolímeros GS Junior: 100 mil leituras, 35 milhões de bases, 400 pb MiSeq: 25 milhões de leituras, 15 bilhões de bases, 300 pb. MiSeq possui apenas uma flow cell com uma lane. Illumina HiSeq: 8 lanes ~200 milhões de leituras per lane = 1.6 bilhões. 1

2 4/11/14 Ion Torrent Ion Proton sequencer Ion Torrent vs Illumina e 454 Ion PGM sequencer Bases: 2 bilhões (Gb) bp Bases: 10 bilhões (Gb) 200bp Ion Torrent Illumina 454 Sequenciamento por semicondutor de íons Terminação reversível da cadeia Pirosequenciamento Emulsion PCR Bridge PCR Emulsion PCR Sequenciamento mediado por ph Sequenciamento Ion Torrent Fevereiro de 2010 Tecnologia Ion Torrent (DNA)n + dntp Polimerase (DNA)n +1 + Ppi + H+ Tecnologia Ion Torrent Homopolímeros: > ΔpH Mudanças minúsculas (0.02) e transientes (meia vida de <1s) de ph. Sensor eletroquímico ISFET (ion sensitive field-effect transistor) Lavagem para retirar dntps. O pequeno tamanho dos poços permite rápida e eficiente difusão, não necessitando enzimas (454 vs Ion: poço de 29 μm vs 4 μm, microesfera de 20 μm vs 2 μm) Robison, 2011 Rothberg,

3 4/11/14 Tecnologia Ion Torrent 3 tamanhos de chip: 1.5 M, 7.2 M e 13 M Tecnologia Ion Torrent Custo Sem ótica Sem cascata de enzimas Sem modificações dos dntps (~454) Rapidez e tamanho da máquina Eliminação da ótica e captação de imagens Mudanças na preparação da biblioteca Homopolímeros 3% erro em homopolímeros de 5 bases. Illumina somente com homopolímeros > 7 bases. Ion Shear Enzyme mix: Automação dos passos mais tediosos e demorados: 1) 2) 3) Cliva ligações fosfodiester aleatoriamente (DNase I?). Fragmentos de finais não coesivos com fosfatos no final 5 e hidroxila no final 3. Problemas: Tamanho dos fragmentos varia com a quantidade de enzima adicionada e temp. Problemas em regiões com >GC 3

4 4/11/14 Bioruptor Sonicator + end repair DNA ligase Nick repair*: Klenow polymerase Nick repair: é necessário porque os adaptadores não são fosforilados (para evitar formação de concatâmeros de adaptadores durante a reação de ligação) 1) E-gel Size Select Agarose Gel 2) Pippin Prep Necessário porque a fragmentação não é completamente controlada 4

5 4/11/14 PCR mix com Taq High Fidelity + primers Se concentração de DNA for baixa Ion One Touch 2 Instrument * Evita erros e formação de concatemeros SOLiD em Ion One Touch empcr Enrichment (Dynabeads MyOne Streptavidin) 5500xl Genetic Analyzer Bases: bilhões (Gb) 50-75pb 5

6 4/11/14 SOLiD vs Ion, Illumina e 454 SOLiD Ion Torrent Illumina 454 Sequenciamento por ligação de oligonucleotídeo e detecção Sequenciamento por semicondutor de íons Terminação reversível da cadeia Pirosequenciamento Emulsion PCR Emulsion PCR Bridge PCR Emulsion PCR Exact call chemistry 2 FlowChips, com seis lanes cada 96 barcodes 80 a 320 bilhões (Gb) de bases 2 x 50 (mate-pair) 1 x 75 pb Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection Tecnologia SOLiD produzida como Ion Torrent Microesferas (1 μm) são ligadas covalentemente a uma superfície de vidro (FlowChip) Final 3 dos fragmentos de DNA são modificados (bead linker) a permitir ligação covalente. stdna é sequenciado por meio da ligação de sondas marcadas com fluorescência (DNA ligase) Tecnologia SOLiD Paired-end em SOLiD São 16 sequências di-nucleotídicas (cada 4 - uma fluorescência) ~10 ciclos são feitos e fita é removida Novo primer com uma base a mais ciclos são repetidos 5 vezes Cada base é lida duas vezes Inspeção adicional com sondas trinucleotídicas (24 combinações) Acurácia de 99.99% 6

7 4/11/14 PacBio PacBio Technology SMRT (Single Molecule, Real Time technology) 1) Phospho-linked nucleotides PacBio RS II Bases: 375 milhões (Mb) Média: 5-8 Kb 2) Câmara de visualização nanofotônica (Zero Mode Waveguide ZMW) condutor de onda eletromagnética PacBio Technology Sequenciamento todo pode ser feito em até 10 horas 7

8 4/11/14 3. Sequenciamento de quarta geração Oxford Nanopore Dúvidas AGBT (Advances in Genome Biology & Technology) Base calls in 6 mers? (4096 combinations) Leitura média: ~5 Kb Leitura máxima: 9 Kb Problemas: length, erros 8